牡丹Ty1-copia类反转录转座子反转录酶序列的克隆和分析

论文摘要

牡丹（Paeonia suffruticosa Andrews.）芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia L.）牡丹组（Sect. Mouton DC.）落叶灌木，是重要的观赏和资源植物。在我国已有2000余年的栽培及应用历史，在长期的栽培和人工选择下，形成了丰富的遗传变异。但目前关于牡丹基因组内反转录转座子的研究未见报道。本试验首次从牡丹基因组中分离了Ty1-copia类反转录转座子反转录酶序列，并对其进行了系统地分析。主要结果如下：1.采用简并引物进行PCR扩增，并对反应体系进行了优化。优化后反应体系为：1×buffer，2mmol/L Mg2+，0.4mmol/L dNTPs，0.8μmol/L简并引物（RTS和RTF），1U Taq酶，DNA模板50ng/μL，双蒸水补足至25μL。PCR反应程序设定为：94℃预变性5min，94℃变性50s，43℃退火50s，72℃延伸1min，72℃再延伸7min，4℃终止反应，其中变性、退火和延伸三个步骤循环35次。从代表牡丹组植物的10个种中都扩增得到了约300bp的目的产物。所有材料扩增结果一致，且无目的产物以外的扩增条带。结果说明Ty1-copia类反转录转座子反转录酶基因广泛存在于牡丹组植物中。2.利用优化的PCR扩增方法从洛阳红（P. suffruticosa cv. Luoyanghong）基因组中成功克隆了59条反转录酶序列。通过CLUSTAL、MEGA和DNAstar软件对序列进行分析可得：碱基序列长度变化范围为：267bp585bp，同源性变化范围为：13.8%92.6%。将59条序列翻译为氨基酸后其中54条序列都存在19个数量不等的终止密码子突变。长度相同的碱基序列翻译为氨基酸后也存在着很大的差异，这充分说明牡丹基因组中该序列存在碱基插入和替代突变。3.根据牡丹基因组中Ty1-copia类反转录转座子反转录酶序列的同源性高低，将其划分为9个不同的Family（Family19）。其中不同Family含有不同的序列条数，Family1包括30条序列，覆盖了所得序列的50%左右，说明其存在的历史最久远，其中反转录酶所对应的反转录转座子的转座活性就越大。Family4、Family8和Family9各含有1条序列，它们相互之间以及与其它家族之间关系都较远，说明其存在的历史比较短。4.将牡丹中反转录酶序列与GenBank中不同物种的28条同源序列进行聚类分析。结果发现牡丹与矮牵牛、小花矮牵牛、番茄、鹰嘴豆、列当、马铃薯、白皮松、宁夏枸杞、枸杞、野茶树、杨树、绿草莓、梅、向日葵和蛇麻黄的亲缘关系较近，这说明牡丹和不同的草本植物、木本植物可能有着共同的起源，同时也证明了不同物种间存在反转录酶所对应的反转录转座子的横向传递。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 植物反转录转座子及其研究进展
• 1.1 反转录转座子的类型和结构
• 1.1.1 反转录转座子的类型
• 1.1.2 反转录转座子的结构
• 1.2 反转录转座子的转座机制
• 1.3 反转录转座子的起源和传递方式
• 1.3.1 起源
• 1.3.2 传递方式
• 1.4 反转录转座子的特性
• 1.4.1 广泛存在
• 1.4.2 高度异质性
• 1.5 反转录转座子对植物基因组的影响
• 1.5.1 基因组的大小
• 1.5.2 基因组的活性
• 1.5.3 基因的突变和重排
• 1.6 反转录转座子的应用和展望
• 1.7 牡丹种质资源的研究进展
• 1.8 本研究的目的和意义
• 第2章 牡丹基因组中 Ty1-copia 类反转录转座子反转录酶基因存在的普遍性
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 牡丹基因组 DNA 的提取
• 2.1.4 RT 基因的扩增
• 2.2 结果与分析
• 第3章 牡丹基因组中 RT 序列的多样性
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 基因组 DNA 的提取
• 3.1.3 RT 基因的扩增
• 3.1.4 扩增产物的回收
• 3.1.5 感受态细胞的制备
• 3.1.6 RT 基因片段的克隆
• 3.1.7 重组质粒的提取和检测
• 3.1.8 目的片段的测序和分析
• 3.2 牡丹 RT 基因片段碱基序列的分析
• 3.2.1 回收产物的检测
• 3.2.2 重组质粒的 PCR 检测
• 3.2.3 碱基序列的 BLAST 比对
• 3.2.4 碱基序列的异质性
• 3.2.5 碱基序列的同源性
• 3.3 牡丹 RT 基因氨基酸序列的分析
• 3.3.1 氨基酸序列比对
• 3.3.2 氨基酸序列的聚类分析
• 3.3.3 牡丹 RT 基因氨基酸序列与其他植物中同源序列的聚类分析
• 第4章 结论与展望
• 4.1 首次从牡丹基因组中分离出反转录转座子反转录酶序列
• 4.2 牡丹基因组中 Ty1-copia 类反转录转座子 RT 基因的多样性
• 4.3 研究展望
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果