绿茶提取物EGCG抗乙型肝炎病毒的分子机理研究

论文摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是导致乙型肝炎及相关疾病的主要病因，由于现有临床药物的诸多缺陷，从天然提取物中筛选新型的抗HBV药物，并对其作用机理进行研究是HBV研究的热点之一。本论文是在前期研究结果绿茶提取物具有较强的抗乙肝病毒作用的基础上，利用HBV稳定表达细胞系HepG2.2.15，对绿茶提取物的抗HBV作用及其机理进行更深一步的研究和探索。实验采用MTT法分析了不同浓度梯度的绿茶提取物单体表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate, ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin, EGC）、表儿茶素（epicatechin, EC）、儿茶素（catechin, C）等几种主要成分对HepG2.2.15细胞的毒性，并在安全浓度范围内分析了这5种单体成分的抗HBV效果，ELISA结果显示，EGCG、EGC、ECG和EC对HBV的抗原表达都有较强抑制作用，其中EGCG抑制HBsAg和HBeAg效果最强，作用9天的抑制效果均能高达99.9%以上，而EGC和ECG次之，其对HBsAg和HBeAg表达的抑制率达到95%以上，EC对HBeAg的抑制率接近50%，因此EGCG是我们得出的优选成分。为进一步研究EGCG抗HBV的分子作用机理，实验采用不同浓度的EGCG对调节HBV转录和复制起关键作用的肝富集转录因子：肝细胞核因子1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1）、HNF3、HNF4、视黄醇X受体（retinoid X receptor, RXR）、过氧化物酶增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）和法尼酯X受体（farnesoid X receptor, FXR）等的表达进行半定量RT-PCR分析。结果表明，随着EGCG作用浓度的增加，HNF1α和HNF4α的表达变化不明显，HNF3β和PPARα的表达有较弱的下调趋势，而EGCG能够明显下调RXRα和FXRα的表达量，随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强。通过用L02细胞和HepG2细胞做对比分析，结果表明，不同浓度的EGCG对这两种细胞中RXRα的表达没有影响。在没有EGCG作用时，三种细胞中RXRα的表达量没有明显差异，而FXRα在L02、HepG2、HepG2.2.15三种细胞中的表达量依次升高，说明HBV基因组的存在上调了FXRα的表达。因此，EGCG可能通过下调RXRα和FXRα的表达来抑制HBV的转录与复制。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 乙型肝炎病毒及乙型肝炎简介
• 1.1.1 乙型肝炎
• 1.1.2 乙型肝炎病毒
• 1.1.2.1 HBV 的结构
• 1.1.2.2 HBV 的基因组
• 1.1.2.3 HBV 的转录与复制
• 1.1.2.4 HBV 的致病性及抗病毒研究
• 1.1.2.5 HBV 细胞模型的选用
• 1.2 肝富集转录因子的研究进展
• 1.2.1 肝富集转录因子简介
• 1.2.2 肝富集转录因子对乙型肝炎病毒的调控研究
• 1.3 绿茶提取物儿茶素的功能
• 1.3.1 绿茶提取物中的表没食子儿茶素没食子酸酯
• 1.3.2 表没食子儿茶素没食子酸酯的抗病毒活性
• 1.3.2.1 EGCG 抗流感病毒
• 1.3.2.2 EGCG 抗艾滋病病毒
• 1.3.2.3 EGCG 抗Epstein–Barr 病毒和腺病毒
• 1.3.2.4 EGCG 抗乙肝病毒的研究
• 1.4 本课题研究目的和意义
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验试剂与耗材
• 3.1.3.1 试剂
• 3.1.3.2 耗材器具
• 3.2 方法
• 3.2.1 试剂与耗材准备
• 3.2.1.1 预备耗材处理方法
• 3.2.1.2 部分试剂配制方法
• 3.2.2 细胞培养
• 3.2.3 MTT 细胞毒性试验
• 3.2.4 ELISA 检测HBeAg 和HBsAg 的表达
• 3.2.5 细胞总RNA 提取、纯化及检测
• 3.2.5.1 细胞总RNA 提取及纯化
• 3.2.5.2 RNA 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.6 RT-PCR 检测EGCG 对肝富集转录因子的表达影响
• 3.2.6.1 cDNA 的合成
• 3.2.6.2 PCR 体系的建立
• 4 结果与分析
• 4.1 绿茶提取物最优成分筛选
• 4.1.1 细胞培养
• 4.1.2 MTT 实验结果
• 4.1.3 不同儿茶素单体对HBeAg 和HBsAg 的表达影响
• 4.1.3.1 不同儿茶素单体对HBeAg 的表达抑制
• 4.1.3.2 不同儿茶素单体对HBsAg 的表达抑制
• 4.2 EGCG 对关键肝富集转录因子的表达分析
• 4.2.1 细胞总RNA 的提取及纯化结果
• 4.2.2 EGCG 对几个关键肝富集转录因子的表达影响
• 4.2.2.1 引物设计及验证
• 4.2.2.2 半定量RT-PCR 结果分析
• 4.2.2.3 EGCG 对不同肝细胞的RXRα和FXRα转录的影响
• 5 结论与讨论
• 5.1 绿茶提取物最优成分筛选
• 5.1.1 MTT 实验
• 5.1.2 ELISA 检测HBeAg 和HBsAg 的结果分析
• 5.2 半定量RT-PCR 分析几种关键肝富集转录因子的表达情况
• 5.2.1 肝富集转录因子的保守性分析与引物设计
• 5.2.2 半定量RT-PCR 分析关键肝富集转录因子的表达
• 5.2.3 EGCG 对三种不同细胞中RXRα和FXRα的表达影响
• 6 参考文献
• ABSTRACT