论文摘要
毒品泛滥严重威胁着人们的身心健康和社会的安全。毒品成瘾（drug addiction）是患者对药物产生了生理上和心理上的依赖,这种依赖感会促使患者不择手段、不计后果地强制获取、使用某种毒品。一旦戒断后,生理上和心理上的依赖感得不到满足,就会产生一系列戒断症状。焦虑和抑郁是毒品戒断后容易出现的症状,其水平的高低反映了戒断症状的严重程度以及对毒品的渴求程度。严重的焦虑和抑郁会促使患者不择手段、不计后果地获取毒品,对自身造成伤害,甚至自杀。因此,开展毒品戒断后情感障碍的研究有重要的科学意义。活化素A（Activin A）是转化生长因子p超家族（TGFβ superfamily）中重要的成员之一,现已经发现其在生物体中具有许多重要的作用。活化素A主要促进卵泡刺激素（FSH）的生物合成和分泌,同时还参与细胞增殖、分化、代谢、免疫反应、组织修复、神经保护以及内分泌功能。有趣的是,研究发现活化素A能够减轻慢性电惊厥刺激以及基因敲除的动物模型的焦虑和抑郁水平,对其相关机制研究认为是活化素A促进海马区神经再生（neurogenesis）而发挥抗焦虑或抑郁的作用。大脑海马区神经可塑性变化与焦虑和抑郁密切相关。海马是情绪整合和学习记忆中枢,参与调节焦虑和抑郁等情感障碍。焦虑和抑郁的发生发展,经常伴随着海马神经可塑性变化。脑部的神经环路和神经连接终生都处于对内外刺激产生重组和修饰的适应性变化过程,这种过程叫神经可塑性,即脑接受信息并对相同或相似的刺激做出适应性反应的基本过程。具体来说为神经元之间通过突触进行信息传递和处理的能力是可以变化的,即具有可塑性。神经可塑性使得脑组织能够像其它组织如皮肤、肝脏等具有自我修复功能,对于个体在不同的内外环境中保持正常的功能非常重要。然而,神经可塑并非在任何情况下都是有利的。可塑性异常会导致神经元反应产生适应不良及出现异常状态。比如,不良的或长时间的刺激会改变使神经发生不良的可塑性变化,引起海马树突萎缩、兴奋性突触缺失,从而引起情感障碍。神经再生（neurogenesis）是神经干细胞或神经前体细胞的增殖（proliferation）、迁移（migration）、分化（differentiation）、功能整合的过程,是脑区神经可塑性变化的表现形式。神经再生被认为部分参与了焦虑和抑郁症状的发生,促进神经再生能够改善焦虑和抑郁症状,具有一定的治疗作用。许多抗焦虑和抑郁作用的药物能够促进海马齿状回（dentate gyrus, DG）神经再生,拮抗海马区发生的不良神经可塑性变化,使各种刺激诱发焦虑和抑郁症状得到缓解丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路是真核生物信号传递中非常重要的信号通路,传递胞外信号到胞内引起细胞生物学反应,在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成份,参与调节细胞增殖、分化、迁移、存活、凋亡、应激、炎症等。其中ERK,JNK, P38是三条重要的MAPK信号通路,其中ERK1/2信号转导通路调控细胞增殖、生长和分化。可卡因戒断24小时-7天后,动物出现明显的焦虑和抑郁症状,但相关机制与治疗尚不明了。基于活化素A在慢性电惊厥刺激以及基因敲除的焦虑和抑郁动物模型中的作用,及活化素A对海马区神经再生的促进作用,本研究提出如下科学问题：1、活化素A是否降低可卡因戒断诱导的焦虑和抑郁水平?2、可卡因戒断过程中,活化素A是否促进海马神经再生?3、可卡因戒断过程中,活化素A是否通过MAPK通路促进海马神经再生发挥抗焦虑和抑郁的作用?本实验昆明小鼠共分为四组：①Saline+PBS组：②Saline+ActivinA组；③Cocaine+PBS组：④ Cocaine+Activin A组。③④昆明小鼠连续注射可卡因（Cocaine） 20mg/kg.d,①②组昆明小鼠连续注射等量的生理盐水（Saline）,四组连续注射14天。给药第8天时候,双侧大脑安放留置针,针孔对着海马齿状回（DG）。立体定位坐标点是前囱后2.0mm,左右径±1.5mm,硬膜下1.8mm。连续注射14天,戒断48小时,检测小鼠焦虑和抑郁指标。进行行为学实验时,按照如下分配小鼠：①Saline+PBS组9只；②Saline+ActivinA组9只：③Cocaine+PBS组10只；④Cocaine+Activin A组10只。小鼠戒断48小时后分别给①③组小鼠大脑双侧海马区注射lul PBS, ②④组昆明小鼠大脑双侧海马区注射50ug/ml的活化素A （Activin A） 1 ul。旷场实验（Open field test）、高架十字迷宫（Elevate plus maze）检测焦虑水平,悬尾实验（Tail suspension test）、强迫游泳（Forced swimming test）检测抑郁水平。旷场试验记录中央路程（center-distance）、中央区域进入次数（center-entries）,中央区,域停留的时间（center-time）,高架十字迷宫记录开臂进入次数（open arm-entries）,开臂停留的时间（open arm-time）,悬尾实验和强迫游泳都记录小鼠不动时间。（immobility-time）。进行免疫组化实验和免疫荧光实验时,按照如下分配小鼠①Saline+PBS组5只；②Saline+ActivinA组5只；③Cocaine+PBS组 5只；④Cocaine+Activin A组5只。小鼠戒断48小时后分别给①③昆明小鼠大脑双侧海马区注射lul PBS,②④昆明小鼠大脑双侧海马区注射50ug/ml的活化素A （Activin A） 1ul,-天一次,连续两天。同时四组小鼠均腹腔注射BrdU200mg/kg,12小时一次,连续注射BrdU三天。进行western blot实验时,按照如下分配小鼠①Saline+PBS组4只；②Saline+ActivinA组4只；③Cocaine+PBS组4只④Cocaine+Activin A组4只。小鼠戒断48小时后分别给①③昆明小鼠大脑单侧海马区立体定位注射lul PBS,②④昆明小鼠大脑单侧海马区立体定位注射50ug/ml的活化素A（ActivinA）1ul。然后在30min后解剖取材。western blot实验检测MAPK通路中ERK在30min的磷酸化水平。结果：1、旷场实验：中央区域停留时间（center-time）中,可卡因组（Cocaine+PBS组）比生理盐水组（Saline+PBS组）在中央区域停留时间显著降低（p<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组在中央区域停留时间显著增加。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。中央路程（center-distance）和中央区域进入次数（center-entries）中,可卡因组（Cocaine+PBS组）与生理盐水组（Saline+PBS组）、Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）与可卡因组以及单独Activin A组与生理盐水组之间均无显著性差异（p>0.05）。2.高架十字迷宫：开臂进入次数（open arm-entries）指标显示,开臂进入次数（open arm-entries）指标显示,可卡因组（Cocaine+PBS组）比生理盐水组（Saline+PBS组）开臂进入次数显著降低（p<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组开臂进入次数显著增加。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。开臂停留的时间（open arm-time）显示,可卡因组（Cocaine+PBS组）比生理盐水组（Saline+PBS组）开臂停留的时间显著减少（p<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组开臂停留的时间显著延长。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。3.悬尾实验：不动时间（immobility-time）显示,可卡因组（Cocaine+PBS组）比生理盐水组（Saline+PBS组）不动时间显著增高（p<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组不动时间显著减少。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。4.强迫游泳：不动时间（immobility-time）显示可卡因组（Cocaine+PBS组）比生理盐水组（Saline+PBS组）不动时间显著增高（p<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组不动时间显著减少。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。5.BrdU标记的免疫组化：结果显示,与生理盐水组（Saline+PBS组）相比,可卡因组（Cocaine+PBS组）海马DG区BrdU阳性细胞总数明显减少（P<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组海马DG区BrdU阳性细胞总数显著增加。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。6. BrdU/Dcx双标免疫荧光：结果显示与生理盐水组（Saline+PBS组）相比,可卡因组（Cocaine+PBS组）海马DG区BrdU/Dcx P日性细胞总数明显减少（P<0.05）。Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组海马DG区BrdU/Dcx阳性细胞总数显著增加。而单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。7. Western blot:实验结果显示ERK通路中,给予活化素A30min后,Activin A治疗组（Cocaine+Activin A组）比可卡因组ERK磷酸化水平显著增高（P<0.05）。可卡因组（Cocaine+PBS组）与生理盐水组（Saline+PBS组）、 单独Activin A组与生理盐水组无显著性差异（P>0.05）。结论：1、活化素A能够降低昆明小鼠可卡因戒断诱导的焦虑和抑郁水平；2、可卡因戒断能够抑制小鼠海马齿状回的神经再生,活化素A能够阻断可卡因戒断对小鼠海马齿状回神经再生的抑制作用,降低可卡因戒断诱导的焦虑和抑郁水平；3、活化素A能通过提高海马齿状回区ERK磷酸化水平促进可卡因戒断后小鼠海马齿状回神经再生。