HSP70作为禽流感病毒基因工程疫苗佐剂的研究

论文摘要

禽流感（AI）,特别是高致病性禽流感（HPAI）已经威胁人类健康和经济发展。应用高效的疫苗并结合广泛开展禽流感的免疫监测是当前、乃至将来很长一段时期控制禽流感的主要措施。禽流感亚型众多,亚型间的交叉免疫反应很弱,而且还可能会出现新亚型流感病毒的流行。流感病毒（AIV）基质蛋白（Matrix 2,M2）、核蛋白（Nucleoprotein,NP）等结构蛋白具有高度保守和交叉免疫保护反应的特性。因此,研究广谱性禽或人流感病毒疫苗和诊断技术成为流感综合防控技术中的新课题。其中,在流感病毒新型疫苗的设计中,关键技术是如何提高抗原刺激机体产生强有力的免疫保护。热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70,HSP70）对机体免疫系统具有重要的调节作用。HSP70可作为分子载体,增强与其结合的蛋白抗原性。因此,在现代疫苗的研究中,HSP70能充当基因工程等新型疫苗的佐剂。在目前,已逐渐撑握和利用细菌源HSP70的免疫调节功能及其机制,但HSP70的生物种属非常多,各个种属间在功能上是否具有特异性,这些仍没有进行系统的研究。哺乳动物源HSP70作为疫苗佐剂的研究较少,分子内部结构与免疫调节功能的关系还不清楚。鉴于以上提出的问题,本研究工作进行了初步的探讨和研究。主要工作和结果如下:成功克隆了含结核杆菌、鹌鹑、鸡和鼠源HSP70编码序列。在基因和氨基酸水平对不同种属源HSP70进行同源性和遗传进化分析。结果显示,同一种源HSP70保守性最高。鸡与鹌鹑间、牛源与犬源间、人源与鸡源间HSP70的同源性分别是98.6%、97.8%、92.1%,从而推测禽源间、牛源与犬源间、人源与鸡源间HSP70功能的一致性较强。大肠杆菌与结核杆菌为代表的细菌源HSP70与禽源及哺乳动物源HSP70同源性均低于50%。可以说,细菌源HSP70的免疫增强功能及其发挥机制均与禽源及哺乳动物源HSP70有较大的差异。各种属源HSP70分子内部结构的氨基酸序列差异分布在核酸结合域和C端区较多,而多肽结合域相对比较保守。运用PCR方法将小鼠HSP70（MsHSP70）基因亚克隆至pET28a（+）和pET32a（+）中,重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌Rosetta（DE3）中。经IPTG诱导表达的可溶性MsHSP70重组蛋白并通过镍离子亲合柱层析纯化。结果表明,MsHSP70成功通过pET32a（+）在Rosetta（DE3）菌中得到表达,纯化后的可溶性目的蛋白纯度达85%。通过大肠杆菌表达系统,重组表达获得TRX-NPe·M2e和GST-NPe·M2e融合蛋白。初步建立以TRX-NP·M2e融合蛋白为检测抗原的间接ELISA方法,对阳性血清的检测,表明GST-NPe·M2e蛋白包被的间接ELISA具有一定特异性和敏感性。以AIV M2e蛋白为模式抗原,初步研究小鼠源HSP70的不同长度分子作为AIV基因工程疫苗佐剂的效应。按同一个阅读框将M2e基因分别融合至HSP70（1-637）、HSP70（383-637）和HSP70（383-537）的C-端。融合基因克隆至pET32a（+）中,三种重组质粒分别转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）plysS或Rosetta（DE3）中。经IPTG诱导表达三种不同长度可溶性重组蛋白,并通过镍离子亲合柱层析纯化。将纯化的三种融合蛋白分别免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测实验鼠血清中特异性M2e抗体。结果表明HSP（383-537）、HSP70（383-637）和HSP70（1-637）均能增强机体产生M2e的特异性抗体。其中HSP（383-537）的作用明显比HSP70（383-637）,特别是要比HSP70（1-637）强。因此,在以AIV M2e蛋白疫苗设计中,小鼠HSP（383-537）能替代MHSP70（1-637）和HSP70（383-637）作为分子佐剂（疫苗载体）。但其中的具体机制有待进一步实验证明。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第一章 热休克蛋白及其抗感染免疫中的作用
• 1 Toll样受体（TLRs）及其介导的信号转导
• 2 热休克蛋白对DC等免疫细胞的调节作用
• 3 热休克蛋白对细胞因子的影响及机制
• 4 热休克蛋白参与抗原提呈与加工
• 5 热休克蛋白与细胞凋亡的关系
• 第二章 禽流感病毒的研究进展
• 1 流行性感冒
• 2 禽流感
• 第二部分 实验研究
• 第一章 四种不同种属源HSP70的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 小鼠HSP70原核表达载体的构建及可溶性表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三章 AIV NPe·M2e融合蛋白的表达以及NPe·M2e-ELISA的初步建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 HSP70作为AIV M2E基因工程疫苗佐剂的初步研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读学位论文期间发表的学术论文