论文摘要
研究目的:刚地弓形虫病是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。不仅对孕妇和新生儿构成了极大的威胁,近年来又成为AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。现有的抗弓形虫药物几乎都存在远期治疗效果差、易复发、价格昂贵且对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等诸多不足,开展新型抗弓形虫药物的研究具有重要的现实意义。药物研究依赖于高效稳定的弓形虫体内和体外培养模型,建立弓形虫培养模型不仅可用于筛选新型抗弓形虫药物,还可用于抗弓形虫药物的作用机理研究。研究方法:弓形虫速殖子腹腔感染昆明小鼠,建立速殖子体内培养模型,并探讨了体内模型长期传代保种的方法。将弓形虫速殖子接种HFF细胞和HeLa细胞,建立速殖子体外培养模型,吉姆萨染色镜下观察速殖子在细胞中增殖的速率。建立速殖子HeLa细胞连续传代保种技术,探讨温度和时间对速殖子产率和活率的影响。探讨胰酶消化法、3μm滤膜过滤法、CF-11纤维素过滤法、Ficoll离心法和Percoll离心法纯化体内培养和体外培养模型获得速殖子的效率。以速殖子HFF细胞培养模型为基础,MTT法测定银杏酸、阿奇霉素和大蒜素对HFF细胞的安全浓度,MTT法和核素掺入法分别测定银杏酸、阿奇霉素和大蒜素对虫体增殖的抑制效果,并探讨药物的作用机理。吉姆萨染色镜下连续观察银杏酸和阿奇霉素对速殖子的抑制效果。以速殖子HeLa细胞培养模型为基础,MTT法测定银杏酸对HeLa细胞的安全浓度,观察不同浓度银杏酸对第一代速殖子和第二代速殖子的抑制作用。Real-Time PCR技术分别测定银杏酸、阿奇霉素、克林霉素和环丙沙星对第一代和第二代速殖子顶质体增殖抑制效果。研究结果:速殖子可在昆明小鼠体内传代保种,每2～3天传代1次。小鼠腹水中速殖子可在液氮中保存2年以上。RH株速殖子可在HFF细胞和HeLa细胞内增殖。HFF细胞接种速殖子后72 h即可被完全破坏,而HeLa细胞则需要96 h才被完全破坏,速殖子在HFF细胞内增殖速度明显快于HeLa细胞。速殖子在HeLa细胞内可进行连续传代保种,目前已传至十代以上。虫体在细胞内增殖速度和传代时间稳定、形态良好,未见毒力明显减弱。在速殖子体外培养研究中发现,将培养于HeLa细胞中速殖子首先置于37℃培养72 h,再置于25℃培养120 h后,速殖子的产率达40倍以上,且活率大于90%,残留很少量Hela细胞。5种纯化方法中,以胰酶消化法的速殖子回收率最高,体内和体外培养速殖子的回收率分别为109.46%和90.96%。Ficoll离心法的回收率最低,体内和体外培养速殖子的回收率分别为0.36%和0.19%。3μm滤膜过滤法和CF-11纤维素过滤法都可以完全清除虫体悬液中的白细胞,但对红细胞的清除效果不明显。CF-11纤维素过滤法的回收率高于3μm滤膜;但3μm滤膜过滤法方便快捷。Ficoll离心法对红细胞清除效果较好,但虫体回收率很低;而Percoll离心法虫体回收率较高,但对红细胞的清除效果不理想。MTT法和核素掺入法测定银杏酸、阿奇霉素和大蒜素的体外抗弓形虫效果显示,银杏酸的抗虫效果与阿奇霉素相近,银杏酸对HFF细胞毒性略低于阿奇霉素。通过吉姆萨染色观察到银杏酸和阿奇霉素均可在8 h内完全清除HFF细胞内培养的速殖子。核素掺入法结果表明,银杏酸和阿奇霉素的抗虫机理在于抑制速殖子DNA和蛋白质的合成。以Real-Time PCR研究银杏酸、阿奇霉素、克林霉素和环丙沙星对第一代和第二代速殖子顶质体增殖的特异性抑制作用。结果表明:经阿奇霉素、克林霉素和环丙沙星处理后的第二代速殖子项质体数量较同代的未用药处理组明显降低,但药物处理后第一代虫体与未处理虫体顶质体数量无显著性差异。经银杏酸处理后的第一代与第二代速殖子顶质体与同代的用药处理组之间无明显差异,银杏酸无特异性抑制顶质增殖能力;但经银杏酸处理后的两代速殖子核基因组拷贝数较相应的未处理组显著降低。结论:弓形虫速殖子体内培养模型操作简单,虫体增殖率高,但代价高昂,液氮保种可作为动物保种的补充。体外培养模型也能获得增殖的速殖子,还可用于速殖子连续传代保种。体外培养模型实验成本比体内培养模型低,体外培养模型更适用于抗弓形虫药物的筛选和药物作用机理的研究。胰酶消化法、3μm滤膜过滤法、CF-11纤维素过滤法、Ficoll离心法和Percoll离心法均可用于体内、体外培养模型速殖子的纯化,不同纯化方法影响速殖子的回收率和纯度,根据后续实验的需要,选择合适的速殖子纯化方法。MTT法和核素掺入法都可用于测定药物体外抗速殖子增殖效果。MTT法操作简单,可以迅速得到结果,但其结果不精确,可用于新型药物的初筛。核素掺入法灵敏度高,结果精确,是目前国内外筛选药物杀虫效果的首选方法,但会造成环境的放射性污染。Real-Time PCR技术可测定药物对弓形虫速殖子顶质体增殖抑制作用,较定量Southern blots方法更为简单实用,可用于筛选特异性抗顶质体药物。银杏酸体外对速殖子的抑制作用与阿奇霉素相近,是一种有发展潜力的抗弓形虫药物。其抗弓形虫速殖子增殖的机理在于抑制核基因组DNA的合成,导致蛋白质合成受阻,从而导致虫体死亡。阿奇霉素既可抑制顶质体的增殖,又可抑制DNA和蛋白质的合成;克林霉素和环丙沙星抗弓形虫机理是特异性地抑制顶质体增殖。
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