转FSH基因克隆猪的制备

论文摘要

我国是世界第一生猪生产和猪肉消费大国,养猪业在我国国民经济中占有重要地位。繁殖性状是养猪业中重要的经济性状之一,包括产仔数、产活仔数、受胎率等。繁殖性状为复杂多基因控制的低遗传力性状,主要受品种遗传、环境、营养、年龄、管理和利用等影响。衡量繁殖性状高低的一个重要指标是产仔数,该性状主要受排卵数、受胎率、胚胎成活率和环境效应等多种因素的影响,常规选育的进展缓慢。自1980年Gurdon首次获得转基因小鼠起,育种专家们陆续将转基因技术应用于畜禽育种,期望迅速提高包括繁殖性状在内的各种生产性能。已有研究表明,促卵泡激素基因（FSH）是影响猪产仔数的主效基因,本实验拟采用体细胞克隆转基因技术生产转FSH基因克隆猪以提高种猪产仔性能。本研究利用FSHα基因的BAC载体,采用缺陷型λ原噬菌体介导的同源重组对二花脸猪FSHα-BAC进行了修饰,插入了能产生抗G418蛋白的Neo基因,获得了FSHα-loxp-Neo-loxp-BAC转基因载体,随后与经相同方法得到的FSHβ-loxp-Neo-loxp-BAC转基因载体混合转染至大白猪胎儿成纤维细胞,经G418筛选后获得稳定表达抗G418蛋白的转基因阳性细胞系,通过显微注射法将体细胞注射到去核猪卵母细胞中,电击融合同时激活转基因胚胎并转入化学辅助激活滴中处理3-4h,待胚胎长至2-4细胞后经手术法移植入受体母猪输卵管深部,等待转基因猪诞生。采用BAC介导的转基因克服了外源基因整合拷贝数过高、基因元件不完整等问题；采用Spindle-view纺锤体示核法系统进行显微去核操作,获得了很高的去核率。本研究为最终制备成具有高繁殖潜力的转FSH基因克隆猪奠定了重要的前期工作基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 动物克隆技术
• 3 动物转基因技术
• 4 转基因克隆技术在家畜育种中的研究与应用
• 5 BAC介导的转基因方法
• 6 高繁殖力基因FSH简介
• 7 本研究的目的和意义
• 第二章 研究正文
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒及菌株
• 2.1.2 大白猪胎儿
• 2.1.3 猪卵巢
• 2.1.4 主要试剂及其配制和主要试剂盒
• 2.1.5 显微操作针的制备
• 2.1.6 主要仪器及耗材
• 2.1.7 主要引物信息
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 BAC-DNA的提取
• 2.2.2 FSH α-loxp-Neo-loxp-BAC的构建
• 2.2.3 胎儿成纤维细胞系建立
• 2.2.4 成纤维细胞系的性别鉴定
• 2.2.5 用FSH α-loxp-neo-loxp-BAC DNA转染猪胎儿成纤维细胞
• 2.2.6 转基因阳性细胞的筛选
• 2.2.7 阳性细胞的检测
• 2.2.8 转基因克隆胚胎的获得
• 2.2.9 胚胎的移植
• 3 实验结果
• 3.1 FSH α-BAC基因信息的确定
• 3.2 FSHα-BAC-SW102菌株的获得
• 3.3 含有-loxp-Neo-loxp-基因打靶载体的获得
• 3.4 FSH α-loxp-neo-loxp-BAC SW102菌株的获得
• 3.5 用于转基因的FSH α-loxp-neo-loxp-BAC载体的提取与鉴定
• 3.6 待转染细胞的性别鉴定
• 3.7 转FSH α-loxp-Neo-loxp-BAC细胞系的建立
• 3.8 孤雌胚的体外发育情况
• 3.9 移植妊娠受孕情况
• 4 分析与讨论
• 4.1 关于转FSHα基因生产高繁殖力克隆猪
• 4.2 BAC载体混合转染
• 4.3 运用Spindle view纺锤体示核法系统去核操作的高成功率
• 4.4 细胞性别鉴定的选择
• 4.5 关于载体的构建
• 4.6 插入的FSH α基因完整性的问题
• 4.7 激活/融合参数对孤雌胚的影响
• 4.8 关于孤雌胚胎的培养
• 4.9 转基因克隆猪的鉴别
• 小结
• 参考文献
• 致谢