13C标记技术测定Escherichia coli TUQ2厌氧中心碳代谢途径通量分布

论文摘要

本文拟采用气质联用（GC-MS）的定量分析手段,通过对13C标记的中间代谢产物标记状态的定量分析,对Escherichia coli TUQ2的中心碳代谢网络通量进行确定,为今后分析确定大肠杆菌生产琥珀酸新的基因改造靶点提供指导依据。本文通过实验确定GC-MS实验前期的恒化操作条件参数和步骤,并建立起实验前期的标记策略、实验后期的GC-MS谱图解析和数据处理的一整套比较完整的分析方法。由于GC-MS底物定量选取策略的复杂性,本文主要采用定性的方法对底物标记方法进行确定。GC-MS的样品取自大肠杆菌添加了13C标记底物的恒化培养经过3个停留时间所得到的中间代谢物的水解产物,为后期中心代谢网络通量的计算提供可靠的实验数据基础。FiatFlux是一款定量研究胞内代谢通量的软件,对于不熟悉数学方法和同位素示踪实验的用户也可以进行胞内通量计算。该软件面向非专业用户,可以满足他们进行特殊研究的要求,包括用13C标记底物、混合物以及生物体。本文中心代谢网络通量的计算可分为四个步骤,首先建立适合该菌体的模型,用MATLAB对模型进行适当的修正。然后是对实验得出的GC-MS谱图的各氨基酸峰进行手动标记,选取一种合适的标记方案,再根据液相色谱测得的胞外通量和反应网络中各步反应的是否发生和其可逆性结合计算,最后以模拟计算和实验数据拟合的最小平方估计F值为优化目标,计算得到大肠杆菌中心代谢网络的通量值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 代谢通量分析（MFA）
• 13C-MFA技术产生的背景'>1.2¹³C-MFA技术产生的背景
• 13C标记实验的原理与方法'>1.3¹³C标记实验的原理与方法
• 13C标记实验的测试平台'>1.4¹³C标记实验的测试平台
• 1.4.1 核磁共振测试平台简介
• 1.4.2 质谱测试平台简介
• 13C标记实验数据处理方法'>1.5¹³C标记实验数据处理方法
• 1.6 MFA的发展历程
• 1.7 本实验研究的主要任务
• 第二章 FiatFlux通量计算原理及可靠性印证
• 2.1 通量计算原理
• α^*的计算'>2.1.1 碎片峰α的质量分布向量MDV_α^*的计算
• AA的计算'>2.1.2 分析物的质量分布向量MDV_AA的计算
• M的计算'>2.1.3 代谢物的质量分布向量MDV_M的计算
• 2.1.4 代谢通量比Metabolic Flux Ratios的计算
• 2.2 FiatFlux可靠性印证
• 第三章 标记实验及GC-MS样品制备
• 3.1 底物标记策略的选择
• 3.1.1 标记策略的种类划分
• 3.1.2 单标记和全标记对网络通量分辨的差异比较
• 3.2 Escherichia coli TUQ2 的恒化培养
• 3.2.1 实验仪器及设备
• 3.2.2 实验药品及试剂的配制
• 3.2.3 菌种和培养基
• 3.2.4 菌种的活化和摇瓶培养
• 3.2.5 发酵罐恒化操作、培养参数及OD值走势
• 3.2.6 发酵罐恒化操作的结果与讨论
• 3.3 GC-MS样品制备及检测方法
• 3.3.1 色谱分离条件
• 3.3.2 样品预处理
• 3.4 细胞量的测定
• 3.4.1 细胞干重测定
• 3.4.2 发酵液吸光度测定
• 3.4.3 OD值与细胞干重的校正曲线
• 3.5 胞外代谢物浓度的测定
• 3.5.1 液相色谱分离条件
• 3.5.2 流动相的配制
• 3.5.3 样品预处理
• 3.5.4 测定结果
• 第四章 网络模型构建及通量计算
• 4.1 网络模型的构建
• 4.2 代谢通量的计算
• 4.2.1 通量计算过程
• 4.2.2 通量计算结果
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢
• 附录