Notch2在人脑胶质瘤中的表达及在胶质瘤细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和肿瘤形成中的作用研究

论文摘要

胶质瘤是人类最常见的脑肿瘤之一预后极差。近些年随着外科技术的进步和术后放疗、化疗的应用,胶质瘤的术后生存率虽然较前有所提高,但平均生存期仍然低于15个月。然而恶性程度最高的胶质母细胞瘤患者的生存率却已经显示出了较为明显的个体差异,个别病例的生存时间已经可以提高到确诊后5年。而且,近年来基础研究领域的新发现也使胶质瘤的治疗产生了突破性的进展,对肿瘤内信号传导机制的研究衍生出针对肿瘤增殖相关的一条或多条信号通路的阻滞治疗和应用抗血管内皮生长因子的靶向抗血管生成治疗已经初步应用于临床。国内外很多大型的研究已经使医生对胶质瘤形成的基因改变和分子基础有了逐步的了解。相信在不久的将来,针对肿瘤生长相关关键分子通路进行治疗的综合治疗方法会减少胶质瘤患者的死亡率和发病率。RNA干扰（RNAi）技术已经不仅仅是研究基因功能的有力工具,它还能迅速的发现药物作用的有效靶点,并通过体外细胞培养等实验技术来得以证实。RNAi技术的产生也为癌症的治疗带来了新的理念和希望。RNAi技术的本质是通过二核苷酸法对选择的基因进行沉默。在生理情况下由细胞质产生的短双链RNA寡核苷酸的基因沉默效果是暂时的,不能够达到理想的实验效果。而细胞核内自身的基因表达序列能够表达短发卡RNA,它能够内源性的干扰目的RNA并且能够产生较稳定的基因敲除效果。体外合成的目的shRNA必须要穿过生理膜屏障,还要进行自我复制来产生持久的干扰效果。质粒或病毒载体能够很好的完成这个任务,如今已经成为shRNA的主要载体。有了成熟的RNAi技术使我们在胶质瘤的分子机制研究中能够更加的深入和具体。近年来Notch信号在肿瘤中的作用已经被证实,一些研究已经发现了脑肿瘤中Notch信号的作用,最近的研究表明Notch信号在人类脑胶质瘤中也发挥作用。但Notch信号在胶质瘤的发生和发展中起到的具体作用还不清楚。本实验应用免疫组化方法对37例脑胶质瘤标本和5例脑组织标本进行Notch2蛋白的检测,研究Notch2在人类脑胶质瘤中的意义。并应用pGFR-Notch2-shRNA干扰质粒对人脑胶质瘤细胞株U251进行转染,采用多种方法对Notch2基因敲除后的胶质瘤细胞株的转染效率、细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡进行检测,同时培养出稳定的Notch2基因敲除细胞株,并应用此细胞株建立裸鼠移植瘤模型,观察Notch2对体内肿瘤的生成和肿瘤生长的影响,为临床肿瘤治疗提供可靠的论依据。本实验共分为四个部分。第一部分Notch2在人胶质瘤细胞中的表达和意义研究目的:探讨Notch2在人脑胶质瘤细胞中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学法对37例WHO分级ⅠⅣ级的新鲜脑胶质瘤标本和外伤或脑出患者内减压手术获得的5例脑组织标本进行Notch2蛋白的检测,比较不同级别胶质瘤和正常脑组织中Notch2蛋白表达差异,分析Notch2蛋白表达和胶质瘤恶性程度的相关性。结果:Notch2在各级人脑胶质瘤标本和正常脑组织标本中均有不同程度表达,与正常脑组织相比胶质瘤中Notch2蛋白的表达显著增高（Z=4.69,P=0.00）,而且Notch2蛋白的表达随着胶质瘤分级增加而增高,呈显著的正相关（spearman相关系数=0.956,P=0.000）。结论:Notch2蛋白在人脑胶质瘤细胞中的表达显著增高,而且表达随着肿瘤分级或恶性程度的增高而增加,与胶质瘤级别的升高呈显著的正相关。Notch2在胶质瘤的进展中有重要的意义,可作为脑胶质瘤临床分级的重要指标。第二部分shRNA靶向干扰Notch2对人脑胶质瘤细胞株U251的影响研究目的:研究Notch2信号对人脑胶质瘤细胞株U251的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:应用脂质体将pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒导入胶质瘤细胞株U251后,应用MTT法检测细胞增殖变化、流式细胞仪检测转染效率、细胞凋亡和细胞周期的改变、RT-PCR和Westenblot检测Notch2基因的抑制效果和干扰后细胞周期、凋亡相关蛋白的表达改变。结果: pGFP-V-RS Notch2 shRNA干扰质粒转染效率为86.68%±2.54%,转染后在mRNA水平和蛋白水平均发生Notch2的表达抑制,与无关序列组和未转染组相比干扰组细胞自第5天开始增殖明显减慢（ P<0.05）,干扰组G0/G1期细胞百分数（68.2 %±1.29% ）显著高于无关序列组和未转染组（35.8 %±2.37%和47.7%±1.03% , P<0.01） ,而干扰组G2/S期细胞（20.4%±1.56%）显著低于无关序列组和未转染组（49.1%±3.65%和35.4%±2.42% , P<0.05）,干扰组细胞的凋亡率显著升高（P<0.05）。细胞周期、凋亡相关蛋白P21上调,cyclinD1、p-Rb下调。结论:Notch2靶向干扰能够显著抑制U251细胞株的增殖、阻滞细胞周期、增加凋亡,为脑胶质瘤靶向治疗提供可靠的依据。第三部分Notch2shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、周期和凋亡的影响研究。目的:探讨稳定转染基因Notch2的短发卡RNA对胶质瘤细胞株U251的生长、增殖、凋亡的长效影响。方法:利用Notch2shRNA质粒及相同载体的无意义序列转入U251细胞,筛选的阳性克隆细胞继续压力培养,建立稳定转染细胞株,应用RT-PCR、western blot检测Notch2表达抑制情况及相关蛋白表达变化,MTT法检测细胞增殖速度,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果:与转染无意义序列组和未转染组相比,稳定转染Notch2shRNA后,Notch2的mRNA和蛋白的表达显著抑制;干扰组第5天开始殖明显减慢（ P<0.05）;干扰组细胞凋亡率15.14±4.26%明显高于对照组和未转染组2.7±1.45% （P<0.05）,干扰组S期细胞百分数（23.1±3.4% ）显著低于对照组和未转染组（41.2±6.9% , P<0.01） ,而干扰组G1期细胞（51.8±3.9%）显著高于对照组和未转染组（38.9±9.7% , P<0.05）;与对照组和未转染组相比干扰组细胞增殖、周期和凋亡相关蛋白p21,p27上调,CyclinD1,MCM2下调。结论:U251细胞株中Notch2表达被长效抑制后,细胞增殖抑制,凋亡增多,为脑胶质瘤基因治疗提供了新的靶点。第四部分Notch2shRNA稳定转染人脑胶质瘤细胞株U251的体内实验研究。目的:研究Notch2蛋白抑制的人胶质瘤细胞株U251的致瘤性及对裸鼠生存时间的影响及机制。方法:收集对数生长期稳定转染的Notch2shRNA-U251细胞株、正常U251细胞株和相同载体无意义序列稳定转染的U251细胞株,应用皮下注射的方法分别建立裸鼠皮下移植瘤模型每组各10只,定期测量肿瘤大小,绘制生长曲线,比较裸鼠生存时间,移植后40天每组处死4只裸鼠,称重标本计算肿瘤抑制率,并对瘤标本进行Notch2免疫组化检测。结果:与未转染组和无意义序列稳定转染组相比,Notch2 shRNA稳定转染组裸鼠肿瘤体积显著减小,从第35天开始存在统计学差异（ F=6.336, P=0.003）,40天后取材显示,未转染组和无意义序列稳定转染组平均瘤重分别为（ 1.375±0.236） g, （ 1.231±0.558） g显著大于Notch2 shRNA稳定转染组（ 0.372±0.079）g,（ F=7.862, P<0.01）,与未转染组和无意义序列稳定转染组比较, Notch2 shRNA稳定转染组肿瘤抑制率达69.872.9%%。未转染组和无意义序列稳定转染组裸鼠均在肿瘤移植后88天内相继死亡,内平均生存时间分别72±3天和73±4天,Notch2 shRNA稳定转染组裸鼠至130观察结束时仍有3只裸鼠存活,平均生存时间112±8天,生存时间显著延长。免疫组化显示与未转染组和无意义序列稳定转染组相比Notch2 shRNA稳定转染组裸鼠瘤组织标本中Notch2水平显著降低（Z=9.87.P=0.00）。结论:U251细胞株中Notch2蛋白显著抑制后,肿瘤在裸鼠体内的生长能力降低,裸鼠生存期显著延长为胶质瘤的基因治疗提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 Notch2 蛋白在人胶质瘤组织中的表达及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 shRNA 靶向干扰Notch2 对人脑胶质瘤细胞株U251 的影响研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 Notch25hRNA 稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251 增殖、周期和凋亡的影响研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 Notch25hRNA 稳定转染细胞株 U251 的裸鼠皮下移植瘤生长及影响机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一 Notch 和微染色体维持蛋白家族在细胞周期调控中的一体化作用
• 参考文献
• 综述二 Notch 信号控制细胞间信息传递和细胞命运
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历