芜菁花青素合成关键基因F3H启动子区序列及蓝光受体CRY1基因的克隆与初步功能分析

论文摘要

依赖于蓝光的花青素合成现象是植物中普遍存在的一种现象,近期研究表明这种现象是由植物蓝光受体—隐花色素（Cryptochrome,CRY）所介导的。本研究对克隆花青素合成依光型芜菁品种“津田”芜菁中的花青素合成关键基因F3H（flavanone 3-hydroxylase）的启动子区序列以及蓝光受体CRY1基因进行了克隆和功能分析,为揭示植物隐花色素对花青素合成的调节机制开展了必要的前期工作。1 F3H启动子区序列的克隆、分析与瞬时表达根据已经公布的Brassica rapa subsp.pekinensis中含有F3H基因的KBrS001M03克隆序列,采用常规PCR的方法,克隆得到“津田”芜菁F3H基因启动子区序列。在线比对和生物信息学分析表明此序列是位于“津田”芜菁F3H基因上游的启动子区序列,具有启动子特征。利用plantcare工具分析统计此序列中的各个功能元件,发现其中除具有一般真核生物启动子结构所普遍具有的保守CAAT box和TATA box等序列外,还有许多其他的保守序列。采用研究启动子的pKGWFS7载体,利用Gateway技术将此序列替换到Gus基因的上游,驱动Gus基因在“津田”芜菁无菌苗的离体胚轴和子叶中瞬时表达。检测结果显示,胚轴和子叶中均有Gus基因表达。而且无论是在光下还是在黑暗中,克隆到的F3H启动子区序列均可驱动Gus基因正常表达。可见所克隆的序列具有启动子功能。2芜菁CRY1基因的克隆与功能初步分析1)CRY1基因的克隆及其功能分析采用RT-PCR的方法克隆芜菁的CRY1基因,对克隆得到序列进行和系统进化树分析,初步确定其为CRY1基因。研究了此基因在不同波长光下的表达情况,结果表明芜菁CRY1基因的表达量基本一致,为组成型表达。这说明CRY1与其他因子发生作用来传递光信号影响花青素的合成。利用酵母双杂交系统研究芜菁CRY1与COP1的相互作用的结果表明两者之间具有相互作用,表明其具有与拟南芥中蓝光受体传递光信号的类似机制。2) CRY1-dsRNAi表达载体的构建与遗传转化为更深入的研究芜菁CRY1的生理功能,采用Gateway克隆系统,根据克隆到的“津田”芜菁CRY1基因序列设计RNA干涉引物,成功构建了芜菁CRY1双链RNA干扰表达载体:CRY1-dsRNAi。采用农杆菌介导的方法转化芜菁,对影响芜菁离体再生和农杆菌介导的遗传转化的各个因素进行了研究。通过对外植体类型、激素种类、AgNO3浓度、无菌苗苗龄、预培养时间等因素的优化,获得了再生频率达90%左右的离体再生体系,可以满足遗传转化的要求。研究发现,采用TDZ代替前人常采用的BA来与NAA配合更适于“津田”芜菁的离体再生,适合再生的激素组合为TDZ 7.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。5.0 mg/L AgNO3对再生来讲是必须的。外植体以苗龄为5d的带柄子叶为好。采用含1.0 mg/L的2,4-D的MS培养基预培养2d可以一定程度上提高再生的频率。在已经建立的芜菁离体再生体系的基础上,研究了不同抗生素种类、农杆菌菌液不同浓度、不同侵染时间、不同共培养时间等因素对遗传转化的影响。得到了较好的转化程序。结果表明采用OD600为0.6的农杆菌菌液侵染20 min后共培养3 d,用300 mg/L的羧苄青霉素脱菌,在含300 mg/L羧苄青霉素和20 mg/L潮霉素的培养基中筛选为好。对转化植株后代进行PCR和Southern-blot杂交分析,结果表明干涉片段已经整合到芜菁基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.2 启动子的克隆方法研究进展
• 1.2.1 利用PCR技术克隆启动子
• 1.2.2 利用启动子探针质粒载体筛选启动子
• 1.2.3 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子
• 1.2.4 通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子
• 1.3 花色素的生物合成以及F3H基因在其中的作用
• 1.3.1 花色素的种类和特征
• 1.3.2 花色素的生物合成途径及相关基因
• 1.3.3 F3H基因及其启动子的研究进展
• 1.4 隐花色素（CRY）的研究概况
• 1.4.1 CRY的发现
• 1.4.2 CRY的生理功能
• 1.5 RNAi技术在植物基因功能组学研究中的应用
• 1.5.1 RNA干涉现象的发现
• 1.5.2 双链RNA干涉的分子机制
• 1.5.3 RNA干涉技术在植物功能基因组研究中的应用
• 1.6 利用农杆菌介导的遗传转化系统在芸薹属中的应用
• 1.6.1 转化机理
• 1.6.2 影响转化效率的各种因素
• 1.6.3 筛选标记
• 1.6.4 目的基因的研究
• 1.6.5 芜菁相近作物通过农杆菌介导遗传转化体系的研究
• 2 "津田"芜菁F3H基因启动子区的克隆与分析
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试材料、菌株、抗生素及质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 "津田"芜菁总DNA的提取（CTAB法）
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 PCR扩增F3H启动子区序列
• 2.2.4 PCR扩增产物的回收
• 2.2.5 PCR产物的连接
• 2.2.6 连接产物转化大肠杆菌
• 2.2.7 筛选后鉴定阳性转化子
• 2.2.8 F3H基因启动子区序列的功能预测
• 2.2.9 F3H基因启动子序列中各功能元件的预测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 F3H启动子区的克隆
• 2.3.2 回收片段的比对分析
• 2.3.3 "津田"芜菁F3H启动子区的序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 F3H启动子区的克隆
• 2.4.2 F3H启动子区功能元件的生物信息学分析
• 2.5 本章小结
• 3 "津田"芜菁F3H启动子区的瞬时表达分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌种及质粒
• 3.1.3 酶和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 PCR引物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 利用Gateway克隆系统构建F3H启动子区表达载体
• 3.2.2 表达克隆转化农杆菌LBA4404感受态细胞
• 3.2.3 农杆菌侵染
• 3.2.4 组织化学染色法检测GUS活性
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 attB-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及回收
• 3.3.2 BP反应阳性克隆检测
• 3.3.3 LR反应阳性克隆PCR检测
• 3.3.4 表达克隆转化农杆菌LBA4404
• 3.3.5 瞬时表达的结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 瞬时表达载体的构建
• 3.4.2 F3H启动子表达的空间特性
• 3.4.3 F3H启动子表达的光调控
• 3.4.4 下一步的研究方向
• 3.5 本章小结
• 4 "津田"芜菁CRY1基因的克隆及其功能初步分析
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 供试材料、菌株、抗生素及质粒
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 "津田"芜菁总RNA的提取
• 4.2.3 CRY1基因的克隆
• 4.2.4 所克隆序列的同源性和结构域预测
• 4.2.5 Northern-blot研究"津田"芜菁不同光环境下CRY1的表达
• 4.2.6 酵母双杂交研究"津田"芜菁CRY1和COP1的相互作用
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 "津田"芜菁总RNA的提取
• 4.3.2 "津田"芜菁CRY1基因的同源性分析及功能预测
• 4.3.3 不同波长的光下"津田"芜菁CRY1基因的表达
• 4.3.4 "津田"芜菁CRY1与COP1的相互作用
• 4.4 讨论
• 4.4.1 "津田"芜菁CRY1基因的克隆及生物信息学分析
• 4.4.2 "津田"芜菁CRY1基因的表达分析及其与COP1的相互作用
• 4.5 本章小结
• 5 芜菁CRY1-dsRNAi载体的构建及其遗传转化
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 供试材料、菌株、抗生素及质粒
• 5.1.2 酶和试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 利用Gateway技术构建CRY1-dsRNAi表达载体
• 5.2.2 CRY1-dsRNAi植物表达载体转化农杆菌
• 5.2.3 外植体的获得与接种方式
• 5.2.4 "津田"芜菁离体再生各影响因素的研究方法
• 5.2.5 "津田"芜菁遗传转化各影响因素的研究方法
• 5.2.6 试验结果的记录及统计分析
• 5.2.7 农杆菌介导转化"津田"芜菁
• 5.2.8 转化植株的分子生物学鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 利用Gateway技术构建CRY1-dsRNAi载体
• 5.3.2 农杆菌转化子的鉴定
• 5.3.3 影响"津田"芜菁离体再生的因素
• 5.3.4 影响"津田"芜菁遗传转化的因素
• 5.3.5 转化植株的获得
• 5.3.6 转化植株的分子生物学检测
• 5.4 讨论
• 5.4.1 CRY1-dsRNAi植物表达载体的构建
• 5.4.2 影响"津田"芜菁离体再生的因素
• 5.4.3 影响"津田"芜菁遗传转化的因素
• 5.4.4 转化植株的分子生物学鉴定
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢