特异基因组位点整合的GLP-1基因治疗策略 ——GLP-1融合蛋白持续表达对小鼠能量稳态的调控

论文摘要

胰升血糖素样多肽-1 （GLP-1）是由小肠黏膜内分泌L细胞合成并分泌的肠促胰岛素激素。GLP-1的主要作用是在胰腺内,包括血糖依赖性的增加胰岛p细胞分泌胰岛素和抑制胰岛α细胞释放胰升血糖素；促进胰岛p细胞增殖和再生,抑制胰岛p细胞凋亡,从而提升胰岛p细胞质量和胰岛p细胞功能。另外,GLP-1还可以增加外周组织如肝脏和肌肉的胰岛素敏感性,减少肠蠕动,增加饱感和减轻体重。天然GLP-1在体内的半衰期很短,不足2分钟,这限制了天然GLP-1在临床的应用价值。因此,目前对GLP-1的研究重点之一就放在了延长其的作用时间。GLP-1类似物显著延长了GLP-1在体内的作用时间,但是仍然需要每天或者每周给药。GLP-1的基因治疗,起到了很好的调控血糖的作用,但是在这些方法中,GLP-1的DNA是仍游离存在于靶细胞基因组外,不能实现GLP-1在体内长期作用。腺相关病毒（AAV）是一种非病原性的复制缺陷型人类病毒,能够特异的将其基因定点整合到人基因组19号染色体长臂（19q13.4）的特定位点（AAVS1）。AAVS1位点被证实是一个安全的可用于外源基因整合的位点。所以,来源于AAV的重组载体,具有不引起转导细胞免疫反应和插入性突变的特点,并能介导转基因的长期表达。以上特点使重组AAV载体成为目前理想的基因治疗载体。对AAV的研究发现,其表达的Rep68/78蛋白和基因组中的RBE元件能够有效的介导AAV的基因组整合。但是由于Rep68//78蛋白还有基因组复制的功能,重组AAV病毒载体系统失去了基因组整合能力。所以,我们需要寻找一种新的基因治疗策略,使重组AAV载体既能有效转染靶细胞,又能将转基因定点整合到AAVS1位点。在这里,我们采用了一种非病毒的基因治疗策略：构建2个载体,一个载体用于表达Rep78蛋白,即Rep78/VRnew,另外一个载体用于表达我们的GLP-1/Fc蛋白,并且在GLP-1/Fc启动子的上游插入一个RBE元件,即RBE/GLP-1/Fc;我们设想将这2个质粒共转移进入靶细胞后,短暂表达的Rep78蛋白协同RBE元件将引导GLP-1/Fc的DNA整合到细胞基因组中。使用PCR结合DNA杂交的方法检测基因组整合。我们的结果显示,GLP-1/Fc以一种Rep78蛋白依赖的方式整合到293细胞基因组的AAVS1位点。使用肌肉注射及电击的方法将质粒RBE/GLP-1/Fc和Rep78/VRnew转移到AAVS1转基因小鼠的肌肉细胞中,我们发现GLP-1/Fc基因整合到转基因小鼠的AAVS1位点,而没有整合到与肝癌密切相关的插入性突变位点mir-341位点。随着基因组的整合,利用免疫组织化学方法在DNA注射部位检测到GLP-1/Fc融合蛋白的表达,利用酶连免疫吸收实验（ELISA）检测到循环中活性GLP-1的水平持续升高。在高脂饮食（HFD）的小鼠模型,结果证实GLP-1/Fc基因治疗明显延缓了小鼠的体重增长和进食量。而且,GLP-1/Fc治疗小鼠的血脂（甘油三脂）水平降低、激素Leptin和Ghrelin水平恢复到正常水平。并且,GLP-1/Fc治疗显著提升了外周组织的胰岛素敏感性。以上结果支持我们的研究揭示了一种新的、无明显副作用的、特异基因组位点整合的非病毒GLP-1基因治疗方法。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章:前言
• 第二章:RBE顺式和Rep反式元件引导GLP-1/Fc基因整合到基因组AAVS1位点
• 第一节:实验流程
• 第二节:材料和方法
• 第三节:结果
• 第三章:GLP-1/Fc基因组整合对高脂饮食小鼠能量代谢的影响
• 第一节:实验流程
• 第二节:材料和方法
• 第三节:结果
• 第四章:讨论和结论
• 第一节:讨论
• 第二节:结论
• 参考文献
• 主要缩略语中英文对照
• 附录一:博士期间发表和代发表论著目录
• 附录二:作为第一作者发表论文全文
• 附录三:综述
• 参考文献
• 致谢