丹参对体外培养人骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨细胞转化的影响

论文摘要

目的探讨丹参对体外培养人骨髓间充质干细胞（ human mesenchymal stem cells.MSCs）的增殖及向成骨细胞转化的影响。将中药研究与细胞工程相结合,推动中药现代化的进程,开拓中药与细胞工程研究,有重要的学术价值、实用价值与社会意义。方法1.建立hMSCs体外分离、培养和鉴定的方法体系。用Percoll梯度分离液离心分离单个核细胞后,置于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱培养、传代扩增。3代以后的细胞用于实验。其中:实验组细胞用10ug/ml丹参素培养液培养,对照组用普通培养液培养。以上二组培养条件同前,换液,传代方法同前。倒置显微镜观察;测定其生长增殖曲线;酶联免疫法行细胞表面抗原检测。鉴定从骨髓中分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。2.定向诱导hMSCs向成骨细胞分化。取生长状态的良好的第三代hMSCs,调整其浓度为105/ml左右,每取0.5ml接种于12孔培养板,当细胞达到60%—70%融合时,弃培养液,实验分成三个平行组（A、B、C）,A组空白组:不加任何诱导济;B对照组:诱导液（普通培养液加100nmol/LDex,10mmol/Lβ- GP,50umol/LAA）进行培养;C组:实验组:诱导液+10ug/ml丹参素培养液,作用24小时后,B组换成新鲜培养液,C组换成10ug/ml丹参素培养液继续培养。视培养基颜色变化,每隔2-3天更换培养液。倒置显微镜逐日观察细胞生长增殖及形态变化情况,行碱性磷酸酶染色和Von—Kossa法钙结节染色。结果1密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离提纯hMSCs,体外培养的原代细胞在48h内有少量细胞贴壁,随后形成纺锥状成纤维细胞样集落单位,随着培养时间的延长,细胞形态逐渐趋于一致;细胞生长增殖活跃;CD29和CD71表达阳性,CD34表达阴性。在诱导培养的第7天实验组碱性磷酸酶染色阳性,第7天Von—Kossa法钙结节染色阳性。对照组细胞碱性磷酸酶染色大部分为阴性,少数为弱阳性。Von—Kossa法钙结节染色无矿化物沉积和黑色结节。空白组碱性磷酸酶染色均显示胞浆呈粉红色,细胞仍然保留清晰的成纤维细胞样外观。结论:1、hMSCs取材安全、方便;密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离提纯hMSCs。2、丹参素培养液可较好的诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 综述