论文摘要
背景：紫外线（UV）包括长波紫外线（UVA）、中波紫外线（UVB）和短波紫外线（UVC）是造成人类皮肤结构和功能改变的主要环境因素。特别是UVB辐射可导致日晒伤，自由基及活性氧的形成，引起细胞因子产生与分泌，局部及系统免疫抑制，细胞DNA损伤及突变频率增加，甚至导致皮肤光老化及皮肤癌肿。细胞凋亡是指细胞在各种因素作用下，由多种凋亡基因调控的一种主动性细胞自杀过程，是细胞的一种死亡方式。细胞凋亡有其自身的形态学、生物化学的特征，以区别与细胞坏死。它是一个程序性过程，需要大量相关蛋白及转录因子特异性表达，并激活核酸酶，将DNA分解成片段，导致细胞死亡。细胞凋亡与胚胎形成、衰老、损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转化等病理、生理过程有密切关系。肿瘤坏死因子（TNF-α）是一重要的促炎症细胞因子，它主要由单核巨噬细胞、T细胞和B细胞分泌。它不仅是杀伤肿瘤作用较强的一种生物活性因子，同时也是一个极其重要的致病因子，参与多种疾病的病理生理过程。TNF-α作用于细胞膜受体TNFR P55和P75，可诱导细胞凋亡、蛋白激酶激活和核转录因子κB（NF-κB）激活，从而导致细胞死亡和炎症发生。TNF-α在炎症反应中具有中枢作用，与UVB辐射引起的炎症反应密切相关。同时，它还是细胞凋亡的诱导因子，UVB辐射能剂量依赖性地增加细胞凋亡对TNF-α的易感性。TNF-α还参与了UVB诱导角质形成细胞（KC）凋亡的机制。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）通路参与细胞生长与分化，细胞周期的调节及细胞死亡等许多生物学行为过程。紫外线辐射导致的DNA损伤通过信号级联反应活化ATR／Chk1、jun、p38 MAPK等信号通路，从而导致核苷酸切除修复（NER）及p53，NF-κB和AP-1等转录因子介导的修复过程的启动。上述过程引起了细胞内非常复杂的反应，启动DNA损伤的修复、细胞周期的活化及细胞凋亡。UVB辐射可诱导TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎症因子分泌增加，由于p38 MAPK的活化是较为重要的一个环节，而且TNF-α在UVB诱导的皮肤细胞凋亡过程中发挥主要作用，故UVB辐射导致的细胞凋亡及TNF-α增加是否是通过活化p38 MAPK途径而实现的有待于证实。绿茶作为一种保健品在全世界广为饮用。近年来，许多研究显示绿茶具有抗炎和抗癌作用。我们及其他研究者的结果也显示在小鼠受UVB辐射前局部外用或在饮水中加入绿茶的主要活性成分表没食子儿荼素没食子酸脂（EGCG）可以防止UVB辐射造成的免疫抑制及肿瘤发生。尽管许多细胞学及分子生物学的实验已证实EGCG具有优良的光保护作用，但在防晒功能上应以外用为重。现在大部分防晒产品都是外用制剂，并以溶液和乳剂为常见。脂质体是一种新的赋形剂，具有透皮性好，可形成药物贮库等特点。本实验旨在研究UVB辐射对BALB／c小鼠皮肤细胞凋亡及p38 MAPK通路的活化和TNF-α表达的影响以及不同剂型EGCG的防护作用有无差异。目的：观察急慢性UVB辐射后BALB／c小鼠皮肤细胞凋亡、TNF-α表达及p38 MAPK通路的活化情况，以及不同剂型EGCG的干预作用。材料与方法：1．实验动物及分组：雌性BALB／c小鼠，6-8周，于实验前一天剃去背部毛发并随机分组：Ⅰ：急性损伤组（180 mJ／cm2／单次）：空白对照组、UVB组、UVB+EGCG丙酮溶液组、UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组、UVB+丙酮溶液组、UVB+乳膏基质组、UVB+空脂质体组，每组6只；Ⅱ：慢性损伤组（30 mJ／cm2／日）：组内处理同前。2．各剂型EGCG配置：EGCG配成浓度为10mg／mL的丙酮溶液、乳膏、脂质体4℃保存。取EGCG250mg，加丙酮至25ml，制成10mg／mlEGCG丙酮溶液。取EGCG250mg，加入硬脂酸，单硬脂酸甘酯，液状石蜡，羟苯乙酯，乳化剂，甘油，制成10mg／ml EGCG乳剂（O／W）备用。以大豆卵磷脂、胆固醇为膜材，采用逆相蒸发法制备得到EGCG脂质体，卵磷脂／胆固醇（摩尔比）为2：1，EGCG浓度为10 mg／ml，包封率可达70％。显微镜下观察到了脂质体结构。平均粒径为327nm，制备的脂质体经室温放置1月，包封率和粒径无明显改变（由东南大学化学系配制）。3．实验动物处理：给药剂量为每平方厘米皮肤外用1mgEGCG（即1mg／cm2）。于小鼠背部皮肤局部外用相应药物后半小时予不同剂量的UVB辐射，急性损伤组予180mJ／cm2UVB单次辐射，24h后处死小鼠取背部皮肤，慢性损伤组予30mJ／cm2UVB辐射，每日1次，连续30天，最后一次辐射后24h处死小鼠取背部皮肤，液氮冷冻保存。4．小鼠皮肤细胞凋亡检测：取小鼠背部皮肤，制作石蜡组织切片，TUNEL法检测凋亡细胞。5．小鼠皮肤细胞TNF-α含量检测：小鼠皮肤组织匀浆后取上清，ELISA法检测TNF-α的表达。6．小鼠皮肤p38 MAPK磷酸化水平检测：提取组织总蛋白，WesternBlotting法测定p38及pp38蛋白表达，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。结果：1．急性损伤组（180mJ／cm2／单次）（1）由于UVB辐射剂量较大，照光组中皮肤细胞大部分细胞发生凋亡，UVB组的凋亡指数（Apoptotic Index，AI）是空白对照组的126.89倍。与单纯UVB组相比，UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组、UVB+丙酮溶液组、UVB+乳膏基质组、UVB+空脂质体组凋亡指数仍较高，且均无统计学差异（P＞0.05）；而UVB组凋亡指数是UVB+EGCG丙酮溶液组的23.169倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）UVB组TNF-α水平与空白对照组相比升高了1.99倍；与单纯UVB组相比，UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组、UVB+丙酮溶液组、UVB+乳膏基质组、UVB+空脂质体组TNF-α的检测水平均无统计学差异（P＞0.05），而UVB组TNF-α的表达水平是UVB+EGCG丙酮溶液组的2.54倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）各组总p38蛋白表达水平差异无明显统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组相比，UVB组pp38蛋白的表达水平增加了2.06倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；与UVB组相比，UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组、UVB+丙酮溶液组、UVB+乳膏基质组、UVB+空脂质体组pp38蛋白的表达水平均无统计学差异（P＞0.05）；而UVB组pp38蛋白的表达水平是UVB+EGCG丙酮溶液组的2.51倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。2．慢性损伤（30mJ／cm2／日）组（1）各处理组的凋亡指数与空白对照组相比均有增高；与单纯UVB辐射组相比，UVB+EGCG丙酮溶液组、UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组分别增高了1.4、5.60及5.77倍；UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组的增高程度更为显著，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）与空白对照组相比，各组TNF-α的表达水平均有增高；与单纯UVB辐射组相比，各加药组TNF-α表达水平的增高均有统计学意义，UVB+EGCG丙酮溶液组、UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组分别增高了27.64％、65.87％及60.21％；UVB+EGCG乳膏组和UVB+EGCG脂质体组的增高程度更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）各组总p38蛋白表达水平差异无明显统计学意义（P＞0.05）；但各组pp38蛋白的表达水平与空白对照组相比均有增高；与单纯UVB辐射组相比，UVB+EGCG丙酮溶液组、UVB+EGCG乳膏组、UVB+EGCG脂质体组分别增高了1.04、3.43及3.32倍；UVB+EGCG乳膏组和UVB+EGCG脂质体组的增高程度更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：急慢性UVB辐射均可导致BALB／c小鼠皮肤细胞发生凋亡，TNF-α表达增加及p38 MAPK磷酸化水平增高。EGCG在急慢性UVB辐射中表现出不同作用。在急性辐射中，EGCG可减少凋亡指数及TNF-α表达，并抑制p38 MAPK通路的活化；就剂型而言，EGCG丙酮溶液效果较好；在慢性辐射中，EGCG却增加皮肤细胞的凋亡及TNF-α表达，并促进p38 MAPK通路的活化；就剂型而言，EGCG乳膏及脂质体效果较丙酮溶液好。
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