论文题目: 溶栓酶基因的克隆及表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 肖璐
导师: 张义正
关键词: 解淀粉芽孢杆菌,豆豉溶栓酶,藤黄微球菌,藤黄微球菌溶栓酶,淀粉酶基因,枯草杆菌,果聚糖蔗糖酶基因,基因克隆,基因表达
文献来源: 四川大学
发表年度: 2005
论文摘要: 通过纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓分析相结合的方法,成功地从环境中筛选到一株纤溶活性较高的细菌菌株。利用细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符。根据细菌16S rDNA的保守序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出该菌的16S rDNA片段,对该序列克隆后测序,并与已报道的序列进行比对,结果表明:它与藤黄微球菌的16S rDNA序列的同源性高达99%。此结果进一步表明,该菌在系统分类学上属于微球菌属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus),将其命名为ML-909。 根据解淀粉芽孢杆菌的豆豉溶栓酶(DFE)全基因、前肽-成熟肽(proDFE)序列、成熟肽编码序列设计3对引物,以ML-909菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,扩增结果表明,从ML-909 DNA中扩增出编码成熟肽的DNA片段。测序结果显示,该片段大小为828bp,与豆豉溶栓酶(DFE)成熟肽基因片段大小完全相同,同源性达到99%,仅有2个碱基的差异,并导致1个氨基酸的变异。该序列编码由275个氨基酸残基组成的酶蛋白,命名为藤黄微球菌溶栓酶(MLFE)。 为了进一步探讨溶栓酶基因的异源表达特性,根据豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端编码序列分别设计2对引物,并在引物N-端和C-端分别引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列,分别以解淀粉芽孢杆菌及藤黄微球菌基因组DNA为模板,扩增出豆豉溶栓酶的前肽.成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽编码区(828bp)。扩增产物克隆到pMD18-T载体中,所获重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,将其克隆到大肠杆菌高效表达质粒pMAL-p2X中,构建溶栓酶基因-麦芽糖结合蛋白基因相融合的表达质粒pMAL-pDFE及
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
第一章 溶栓酶的产生菌筛选、鉴定及其基因克隆
摘要
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.2 实验方法
3 结果
3.1 溶栓酶产生菌ML-909的表型和生化鉴定
3.2 溶栓酶产生菌ML-909的分子鉴定
3.3 溶栓酶基因的克隆与序列分析
3.4 MLFE与其它蛋白酶基因的比较
3.5 ML-909纤溶酶活性的检测
4 讨论
4.1 纤溶酶产生菌的筛选方法
4.2 纤溶酶基因的同源性
4.3 MLFE基因的结构
4.4 MLFE蛋白质结构的预测
小结
参考文献
第二章 溶栓酶基因在大肠杆菌中的表达
摘要
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.2 实验方法
3 结果
3.1 表达质粒的构建策略
3.2 proDFE和MLFE的PCR扩增
3.3 proDFE和MLFE基因的克隆及重组子的鉴定
3.4 proDFE和MLFE表达质粒的构建
3.5 转化细胞的培养及融合蛋白的诱导表达
3.6 融合蛋白的纯化
3.7 表达蛋白的溶栓酶活性检测
4 讨论
4.1 溶栓酶基因在大肠杆菌中的表达
4.2 豆豉溶栓酶基因在大肠杆菌中与MBP基因融合表达的分析
4.3 在大肠杆菌中表达有活性豆豉溶栓酶的展望
小结
参考文献
第三章 溶栓酶基因在枯草杆菌中的组成型表达
摘要
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.2 实验方法
3 结果
3.1 溶栓酶基因枯草杆菌组成型表达载体的构建策略
3.2 解淀粉芽孢杆菌DC-4α-淀粉酶基因启动子-信号肽编码区的克隆与序列分析
3.3 溶栓酶基因表达质粒的构建与鉴定
3.4 重组溶栓酶基因在枯草杆菌中的表达
3.5 DFE基因工程菌WB-DFE5(WB600／pSU-AmyDFE)发酵条件的研究
3.6 溶栓酶(DFE)基因表达产物(rDFE)的纯化
4 讨论
4.1 解淀粉芽孢杆菌DC-4α-淀粉酶启动子-信号肽序列的分析
4.2 溶栓酶基因前肽的作用
4.3 不同溶栓酶基因在枯草杆菌中表达产物的活性比较
4.4 表达宿主菌的选择
4.5 rDFE的纯化
4.6 融合基因构建的策略
小结
参考文献
第四章 豆豉溶栓酶基因在枯草杆菌WB600中的诱导表达
摘要
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.2 实验方法
3 结果
3.1 豆豉溶栓酶基因蔗糖诱导表达载体构建策略
3.2 果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列(sacR)的克隆和序列分析
3.3 豆豉溶栓酶融合基因(SacDFE)的构建
3.4 重组表达质粒pSU-SacDFE的构建与鉴定
3.5 重组质粒pSU-SacDFE在WB600中的诱导表达
3.6 枯草杆菌感受态细胞转化方法的改进
3.7 融合基因SacDFF表达产物的SDS-PAGE分析
3.8 不同诱导时间对基因表达的影响
4 讨论
4.1 sacR对豆豉溶栓酶基因表达调控的分析
4.2 提高豆豉溶栓酶基因表达的策略
4.3 枯草杆菌转化方法的比较
小结
参考文献
文献综述
摘要
Ⅰ 蛋白酶表达系统的研究进展
1 原核表达系统
1.1 大肠杆菌表达系统
1.2 枯草杆菌表达系统
1.3 其它原核表达系统
2 真核表达系统
2.1 酵母表达系统
2.2 昆虫细胞表达系统
3 其他的真核表达系统
3.1 木霉表达系统
3.2 丝状真菌表达系统
Ⅱ 蛋白酶基因的体外定向进化研究进展
1 酶基因的定点突变
2 随机诱变
2.1 通过易错PCR(error-prone PCR)产生随机突变
2.2 化学诱变剂介导的随机诱变
2.3 由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变
3 基因体外重组
3.1 限制性酶切再连接介导的基因重组
3.2 DNA改组
3.3 交错延伸技术
3.4 临时模板随机嵌合技术
3.5 SCRATCH技术
4 筛选
参考文献
致谢
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声明
发布时间: 2005-10-08
参考文献
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