溶藻弧菌相关分离株分子鉴定和生理生态特性研究

论文摘要

弧菌属（Vibrio）隶属于γ-变形杆菌纲弧菌科（Vibrionaceae），是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌，广泛存在于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内，部分弧菌能使海水养殖鱼虾、贝类患弧菌病（Vibriosis）。弧菌快速准确的鉴定是研究其致病机理、开发相关疫苗及其他病害防治措施的基础。哈维群弧菌是弧菌属的核心菌群，它们在表型和遗传型上均十分相似，它们的16S rRNA基因相似性多在99%左右，要准确鉴定各种具有一定难度。本文比较了16SrRNA基因, toxR基因、pyrH基因和rpoB基因对溶藻弧菌相关分离株的分辨力。16S rRNA基因比对结果显示，弧菌16S rRNA基因存在种内差异大于种间差异的情况。溶藻弧菌模式株ATCC17749T的2个16S rRNA基因序列（X56576, X74690）之间的相似性只有98.8%，序列X74690与哈维群弧菌其他5个种模式菌株序列的相似性均高于98.8%。PCR-DGGE图谱显示分离菌16S rRNA基因具有多条带；对菌株418的16S rRNA基因克隆及测序分析发现该菌株存在6条差异序列，差异区域集中在V3区（455-479bp，E. coli位点）占差异位点的60-66.7%，差异位点与菌株41816S rRNA基因简约序列图谱上的重叠峰一致。因此，16S rDNA比对于弧菌种的鉴定的参考意义已经不大。单拷贝基因toxR和pyrH序列在溶藻弧菌种内差异（81.0-99.1%toxR，96.4-98.7%pyrH）均小于种间差异（52.8-71.6%toxR，86.6-91.8%pyrH），因此，toxR和pyrH基因可用于溶藻弧菌的鉴定。基于toxR基因相似性比较可清楚地将18个疑似溶藻弧菌分离株和5个参比株归并到4个种；toxR基因系统发育学分析也显示，哈维群弧菌各种独立地聚类分支，且溶藻弧菌种内存在两个明显差异的聚类分支，说明两个分支的溶藻弧菌具有独立的进化方向。pyrH基因的相似性比较和发育学分析也得到与toxR基因类似的结果，但toxR基因较pyrH基因多态性位点更多，因而具有更强的分辨力，也是设计特异性引物和探针的理想靶基因。rpoB基因相似性比较和发育学分析显示出较弱的分辨率（种内97.1%-99.5%，种间95.0%-98.7%），在鉴定溶藻弧菌时也有一定的错误率。建议在实际应用中先采用toxR基因对溶藻弧菌进行快速鉴定，如有必要，再选用pyrH基因对鉴定结果进行验证。哈维群弧菌中溶藻弧菌与副溶血弧菌的生理生化反应极其相似，10%NaCl和蔗糖利用为两者典型的生化区分法，但在分离菌中存在副溶血弧菌能在10%NaCl弱生长，溶藻弧菌不利用蔗糖的情况，因此，生化鉴定法如要达到100%的可信度，需用分子方法复证。分离弧菌都具有反硝化功能，这是引起水质恶化的重要原因之一。弧菌产胞外酶能力与环境条件及其相关，环境中分离的弧菌产胞外酶等致病因子较少，而养殖水和病害蟹分离菌具有明显产蛋白酶能力。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 弧菌概述
• 1.1.1 弧菌的分类地位
• 1.1.2 弧菌的致病性
• 1.2 弧菌的鉴定方法
• 1.2.1 基于生理生化的弧菌鉴定法
• 1.2.2 基于保守基因的弧菌鉴定法
• 1.2.3 基于看家基因的弧菌鉴定法
• 1.3 弧菌生理生态特征及适应性
• 2 溶藻弧菌相关分离株的分子鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 培养基、试剂与仪器
• 2.2.3 菌株分离纯化
• 2.2.4 基因组 DNA 的提取和 PCR 扩增
• 2.2.5 基因测序、序列分析及系统发育树的构建
• 2.3 结果
• 2.3.1 基于 16S rRNA 基因初判溶藻弧菌及其相近种
• 2.3.2 基于 toxR，rpoB 和 pyrH 基因序列的鉴定
• 2.3.3 toxR, rpoB 和 pyrH 基因的同源性分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 弧菌基因组内 16S rRNA 基因的多拷贝
• 2.4.2 溶藻弧菌的快速鉴定
• 2.5 小结
• 3 弧菌 16S rRNA 基因异质性
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 培养基、试剂与仪器
• 3.2.2 基因组 DNA 的提取和 PCR 扩增
• 3.2.3 变性梯度凝胶电泳
• 3.2.4 16S rDNA 克隆文库的构建
• 3.3 结果
• 3.3.1 16S rRNA 基因 PCR-DGGE 指纹分析
• 3.3.2 菌株 41816S rDNA 克隆文库分析
• 3.3.3 菌株 41816S rDNA 异质性分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 弧菌16S rDNA 多拷贝
• 3.4.2 弧菌16S rDNA 异质性
• 3.5 小结
• 4 溶藻弧菌相关分离株生理生态研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 生理生化测定
• 4.2.2 弧菌生态功能的测定
• 4.2.3 产胞外酶检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 生理生化分析
• 4.3.2 弧菌生态功能的分析
• 4.3.3 产胞外酶
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 5 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.1.1 16S rRNA 对溶藻弧菌相关分离株的分辨力
• 5.1.2 溶藻弧菌相关分离株分子鉴定方法
• 5.1.3 弧菌 16S rRNA 基因的异质性
• 5.1.4 溶藻弧菌相关弧菌生理生态功能
• 5.2 创新
• 5.2.1 研究方法
• 5.2.2 研究内容
• 参考文献
• 附录：生理生化特征总表
• 在学研究成果
• 致谢