β-甘露聚糖酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究

论文摘要

p-甘露聚糖酶是一类能够水解p-1,4-D-甘露糖苷键连接的甘露聚糖的内切水解酶,属于半纤维素酶类,广泛存在于动植物和微生物中,它与其它半纤维素酶协同作用能够有效的水解半纤维素。目前它已被广泛运用于很多行业之中,近年来已成为研究的热点。但总体而言,p-甘露聚糖酶的低产量和运用的高成本严重地限制了其应用的规模和范围,能改变这种状况的最直接的途径就是筛选和培育高产β-甘露聚糖酶的野生菌株。本研究旨在从采集的土壤样品中筛选得到p-甘露聚糖酶的产生菌株,并对其进行鉴定,在优化菌株产酶培养基成分和培养条件的基础上,对其所产β-甘露聚糖酶初步纯化后进行酶学性质研究,为p-甘露聚糖酶基因工程菌的构建和最终实现大规模的工业化生产奠定基础。通过本研究,得到以下主要结果：1.以从四川农业大学老板山针叶林、农场魔芋种植地采集到的土壤样品为材料,经富集培养和刚果红分离培养基初步筛选,得到了20株产β-甘露聚糖酶的菌株；从其中选择变色圈直径与菌落直径之比值（H/C值）较大的6株菌进行液体发酵培养复筛,通过对其p-甘露聚糖酶酶活力的测定,最后选择酶活力最高（11.36 U/mL）的6号菌株作为后续的实验材料,并将其自命名为J6。最后通过形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,将J6菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。2.通过对碳源的种类和浓度、氮源的种类和浓度、金属离子的种类和浓度、培养基的初始pH、培养温度、摇瓶装液量和摇床转速等方面的单因素试验和正交试验,得到J6产p-甘露聚糖酶的最适培养基成分和培养条件：魔芋精粉1.0%、蛋白胨1.0%、酵母抽提物0.5%、K+1 mmol/L、Mn2+ 4mmol/L、 pH5.5,装液量70/250 mL、培养温度35℃、摇床转速160rpm。在此条件下发酵培养,菌株最高产酶活性（62.92U/mL）是优化前（11.36 U/mL）的5.54倍。3.对菌株所产p-甘露聚糖酶经硫酸铵分级盐析、丙酮沉淀和Sephadex G-75层析分离纯化,最终得到电泳纯的p-甘露聚糖酶,其大小为48.0 KD；该β-甘露聚糖酶的最适反应温度为65℃、最适反应pH为6.5,在60-80℃范围内的热稳定性较高,在pH6.5-8.0范围内保持较高的酶活并在pH 5.0-8.0的范围内表现出了较高的稳定性；终浓度分别为1mmol/L的K+、Ca2+、Mn2+、Ba2+这四种金属离子对该p-甘露聚糖酶有激活作用,而Fe3+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Na+这五种金属离子有抑制作用,并以Zn2+、Cu2+的抑制作用最为强烈；以魔芋精粉为底物时的动力学常数Km=10.42 mg/mL, Vmax=136.97 μmol/（min·mL）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 β-甘露聚糖酶的定义
• 1.2 β-甘露聚糖酶的分类
• 1.3 β-甘露聚糖酶的来源及酶学性质
• 1.3.1 植物来源的β-甘露聚糖酶
• 1.3.2 动物来源的β-甘露聚糖酶
• 1.3.3 微生物来源的β-甘露聚糖酶
• 1.4 β-甘露聚糖酶产生菌的筛选与鉴定
• 1.4.1 β-甘露聚糖酶产生菌的筛选
• 1.4.2 β-甘露聚糖酶产生菌的鉴定
• 1.5 β-甘露聚糖酶的分离纯化与活性测定
• 1.5.1 β-甘露聚糖酶的分离纯化
• 1.5.2 β-甘露聚糖酶活力的测定
• 1.6 β-甘露聚糖酶的诱导表达
• 1.7 β-甘露聚糖酶的应用
• 1.8 本研究的目的意义与主要研究内容
• 1.8.1 目的意义
• 1.8.2 主要研究内容
• 第二章 产β-甘露聚糖酶菌株的筛选与鉴定
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 供试土样
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂与溶液
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 土样预处理及富集培养
• 2.2.2 菌株的分离纯化及初筛
• 2.2.3 菌株的复筛
• 2.2.4 粗酶液的制备
• 2.2.5 粗酶液酶活力的测定
• 2.2.6 菌种的保藏
• 2.2.7 甘露聚糖酶产生菌株的形态学及生理生化鉴定
• 2.2.8 菌株16S rDNA的分子生物学鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 甘露糖标准曲线的绘制
• 2.3.2 产酶菌株的富集与初筛
• 2.3.3 产酶菌株的复筛
• 2.3.4 菌株的形态学鉴定
• 2.3.5 菌株的生理生化鉴定
• 2.3.6 菌株的分子生物学鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 产β-甘露聚糖酶菌株的产酶条件优化
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要试剂与培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株产β-甘露聚糖酶培养条件的单因素实验优化
• 3.2.2 菌株产β-甘露聚糖酶培养条件的正交试验
• 3.2.3 菌株产β-甘露聚糖酶的产酶曲线绘制
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 碳源种类对菌株产酶的影响
• 3.3.2 碳源浓度对菌株产酶的影响
• 3.3.3 氮源种类对菌株产酶的影响
• 3.3.4 氮源浓度对菌株产酶的影响
• 3.3.5 金属离子种类对菌株产酶的影响
• 3.3.6 金属离子浓度对菌株产酶的影响
• 3.3.7 培养基初始pH对菌株产酶的影响
• 3.3.8 培养温度对菌株产酶的影响
• 3.3.9 装液量对菌株产酶的影响
• 3.3.10 摇床转速对菌株产酶的影响
• 3.3.11 正交试验
• 3.3.12 菌株产酶曲线的测定
• 3.4 讨论
• 第四章 β-甘露聚糖酶的初步纯化及其酶学性质研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要试剂与溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 蛋白质含量的测定
• 4.2.2 β-甘露聚糖酶活力的测定
• 4.2.3 β-甘露聚糖酶粗酶液的纯化
• 4.2.4 β-甘露聚糖酶的酶学性质研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 蛋白质含量标准曲线的绘制
• 4.3.2 β-甘露聚糖酶的硫酸铵盐析曲线的测定
• 4.3.3 β-甘露聚糖酶的丙酮沉淀曲线的测定
• 4.3.4 β-甘露聚糖酶的葡聚糖凝胶G-75层析
• 4.3.5 β-甘露聚糖酶的纯化结果
• 4.3.6 β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE检测
• 4.3.7 温度对β-甘露聚糖酶活力的影响
• 4.3.8 pH对β-甘露聚糖酶活力的影响
• 4.3.9 常见金属离子对β-甘露聚糖酶活力的影响
• 4.3.10 酶反应动力学常数的测定
• 4.4 讨论
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录1
• 附录2
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢