柳蚕卵黄原蛋白基因的克隆与表达分析

论文摘要

柳蚕是一种尚未开发的野生绢丝昆虫,国内外对柳蚕的研究并不多,且大部分都是关于形态学和生物习性方面的报道和记载。柳蚕的卵黄原蛋白是由大小两个亚基组成,分子量分别是175 KDa和45 KDa。卵黄原蛋白作为昆虫卵黄发生的主要蛋白之一,除了具有营养功能外,在生物体内还具有许多其他重要的生物学功能。近些年来,关于昆虫卵黄原蛋白基因的研究是热点,不断有蚕卵黄原蛋白的一级结构被解析,但柳蚕卵黄原蛋白全基因序列至今未解析。该研究结果可为进一步研究卵黄原蛋白在柳蚕中的功能及其应用提供参考。本文根据已解析的柳蚕卵黄原蛋白cDNA序列和家蚕、天蚕、柞蚕卵黄原蛋白5′端调控区的序列,设计特异性引物,其中有10对引物从柳蚕基因组DNA中扩增出了其卵黄原蛋白基因的10个DNA片段,经克隆、测序和分析后获得了柳蚕卵黄原蛋白的基因序列（GenBank登录号:GU361974）,基因全长7329 bp,包含6个外显子,5个内含子以及一段206 bp的5′端调控区序列,其中外显子的大小分别为2246 bp、205 bp、982 bp、879 bp、184 bp和863 bp;内含子的大小分别为107 bp、84 bp、626 bp、706 bp和230 bp。与其它已解析的昆虫卵黄原蛋白基因比较发现,柳蚕和柞蚕的卵黄原蛋白基因结构更为相似,它们均在起始密码子ATG后31 bp处有一个大的内含子缺失。在5′端调控区发现了BmDsx结合位点以及CdxA和GATA-X调控元件。同时,提取柳蚕雌蚕不同时期和不同组织的总RNA,以M-MLV反转录第一链cDNA,以柳蚕18S rRNA基因做内参,摸索条件后进行了半定量RT-PCR。实验结果显示,柳蚕卵黄原蛋白基因在5龄第1、4、7、11天时未表达,预蛹期达到一个相当高的水平,随后又开始下降,直至滞育期其量又稍有上升;且在中肠、头、马氏管中不表达,在血液、脂肪体和卵巢中有所表达,但表达量无明显差异。这说明柳蚕卵黄原蛋白的表达存在明显的时期和组织的特异性。PCR法扩增了柳蚕卵黄原蛋白的小亚基,并连接至pET-28a（+）表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,用IPTG进行了不同浓度和不同时间的诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot检测,表明被诱导的目的蛋白均得到了稳定的表达,这为以后对卵黄原蛋白的真核表达及其功能的进一步研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫卵黄原蛋白研究进展
• 1.1.1 昆虫卵黄原蛋白的结构与特性
• 1.1.2 昆虫卵黄原蛋白基因的合成
• 1.1.3 昆虫卵黄原蛋白基因的摄取
• 1.1.4 昆虫卵黄原蛋白基因的调控
• 2 引言
• 2.1 研究的目的及意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 柳蚕卵黄原蛋白基因序列的测定
• 2.2.2 柳蚕卵黄原蛋白转录水平的研究
• 2.2.3 柳蚕卵黄原蛋白表达水平的研究
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 常用溶液的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 柳蚕的饲养
• 3.3.2 柳蚕组织的收集
• 3.3.3 柳蚕基因组DNA的提取
• 3.3.4 柳蚕总RNA的提取
• 3.3.5 提取的基因组DNA及总RNA的质量检测
• 3.3.6 柳蚕卵黄原蛋白基因的PCR扩增
• 3.3.7 PCR扩增后目的产物的纯化
• 3.3.8 感受态细胞的制备
• 3.3.9 目的片段的连接和转化
• 3.3.10 柳蚕卵黄原蛋白基因序列的拼接与分析
• 3.3.11 柳蚕卵黄原蛋白小亚基的原核表达
• 3.3.11.1 第一链cDNA的合成
• 3.3.11.2 柳蚕卵黄原蛋白小亚基全长cDNA的扩增
• 3.3.11.3 原核表达载体的构建
• 3.3.11.4 菌液的诱导表达
• 3.3.11.5 SDS-PAGE电泳检测
• 3.3.12 Western blot分析
• 3.3.13 柳蚕卵黄原蛋白转录水平的研究
• 3.3.13.1 总RNA的提取
• 3.3.13.2 半定量RT-PCR
• 4 结果
• 4.1 柳蚕的饲育与观察
• 4.2 柳蚕基因组DNA及总RNA的检测
• 4.3 第一链cDNA浓度的测定
• 4.4 柳蚕卵黄原蛋白基因PCR扩增结果
• 4.5 柳蚕卵黄原蛋白基因序列的测定和分析
• 4.6 柳蚕卵黄原蛋白基因转录水平的研究
• 4.6.1 PCR扩增条件的确定
• 4.6.2 柳蚕卵黄原蛋白不同时期的表达
• 4.6.3 柳蚕卵黄原蛋白不同组织的表达
• 4.7 原核表达载体的构建
• 4.7.1 柳蚕卵黄原蛋白小亚基的扩增
• 4.7.2 双酶切鉴定
• 4.8 柳蚕卵黄原蛋白小亚基的诱导表达
• 4.9 Western blot检测
• 4.10 不同条件下的原核表达
• 4.10.1 IPTG不同诱导浓度的原核表达
• 4.10.2 IPTG不同诱导时间的原核表达
• 5 讨论
• 5.1 柳蚕的饲养
• 5.2 柳蚕卵黄原蛋白基因的一级结构
• 5.3 半定量PCR
• 5.4 柳蚕卵黄原蛋白小亚基的原核表达
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介