青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因克隆与表达

论文摘要

马铃薯（Solanum tuberosum）是重要的粮菜兼用作物,其适应性强、丰产性好、营养丰富、经济效益高、适于加工,在食物安全结构中具有举足轻重的地位。马铃薯种植和生产常受青枯病（Ralstonia solanacearum）的严重威胁。因此加速病害控制和抗病育种研究显得非常重要,这就迫切要求阐明马铃薯与青枯菌互作的分子机理,挖掘和利用优良抗性基因用于马铃薯抗病遗传结构的改造。目前关于马铃薯应对青枯菌的防卫或抗病相关基因的种类、数量及其表达调控等知之甚少。本论文针对马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导的防卫相关基因及其表达模式进行初步研究,目的在于为揭示马铃薯与青枯菌互作的分子机制提供一些有用信息。本研究以伤根灌菌法接种马铃薯,应用抑制差减杂交技术构建病原诱导后差异表达EST文库;应用SMART技术构建富集青枯菌诱导的防卫相关基因cDNA文库;从差异表达EST文库中筛选与防卫相关的增强表达基因片段,采用基因本体论（gene ontology,GO）对其进行功能注释和分类;结合快速扩增cDNA末端技术获得部分防卫相关基因的全长cDNA,然后对其诱导表达模式进行qRT-PCR和Northern杂交验证。主要结果如下:1.通过构建马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导表达基因的差减EST文库,筛选鉴定出上调表达EST共计189条。利用同源检索结合GO术语（GO term）初步确定了防卫相关基因122个,它们分别属于生物过程（25.42%）、分子功能（40.98%）、细胞组分（15.57%）。随机抽取5条EST做RT-PCR分析,证明其在病程早期明显受到青枯菌的诱导上调表达。2.结合GO分类和先验基因功能分析,展示了自根系接种青枯菌诱导感病马铃薯基因型防卫相关基因的EST内容;通过与同类病害的相关EST的纵向比较以及与另外一种维管束系统病害葡萄皮尔斯病病原苛养木杆菌诱导的葡萄EST转录谱的横向比较分析,找出了它们与本研究中防卫相关基因EST的异同;初步鉴别出一些可用于辨识抗性的关键防卫基因,这些基因可用来作为开发抗病品种可能的分子靶标。3.利用富集青枯菌诱导的防卫相关基因cDNA文库与RACE结合的方法,克隆了11条关键防卫基因的全长cDNA,包括非特异性脂质转移蛋白（StLTPa1,StLTPa7,StLTPb1,StLTPb3, StLTPf10）、印膜蛋白（StREMa4）、植物铁蛋白（StFb8）、开心蛋白（StYPa5）、蛋白酶抑制子（StPIa3）、MBF转录因子（StMBFb7）、NAC转录因子（StNACb4）等。4.结合青枯菌诱导、化学处理、环境扫描电子显微镜和EDAX能谱分析,发现非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7在马铃薯与青枯菌互作早期表现与钙相关、受病菌诱导的系统表达模式,非生物激发子水杨酸、茉莉酸、脱落酸以及一定浓度的氯化钙能够诱导该基因增强表达,钙离子通道抑制剂钌红可以抑制其表达;原位杂交显示其转录物主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中积累,暗示其在青枯菌入侵和定殖的微管束系统中发挥作用。StLPTa7基因可能参与马铃薯系统获得抗性中的长距离信号转导。对这种钙离子相关的基因表达模式在抗病反应中的作用机制提出了一个可能的工作模型。5.对另一个非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的表达分析表明,该基因在马铃薯的抗病基因型和感病基因型中差异诱导表达:在抗病基因型中的诱导表现得更快、更高、更强。在远离根部接种位点的组织和靠近接种位点的组织中的表达差异明显。该基因同样受水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。其表达特性与植物的抗病类型有一定的因果关系。6.从马铃薯根际土壤和块茎中分离到两株低温适应型青枯菌菌株,对其进行微生物学、病理学特征分析和分子鉴定,发现其属于青枯菌生理小种3号、生化变种2号,具有小菌落、小细胞、胞壁加厚、生长缓慢、细胞自聚、对固体培养基具强粘附性、潜伏感染等诸多小菌落变异株（small colony variants,SCVs）特征。检测其潜伏感染马铃薯后,非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7和StLTPa1的表达,结果表明SCV不能诱导这两个基因的上调表达,说明该防卫基因的表达与病菌的致病性相关。通过文库构建、基因克隆及其表达模式研究,本论文确定了自根系接种的感病马铃薯基因型早期防卫相关基因的种类、数量;初步确定了非特异性脂质转移蛋白的表达模式;发现青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因与苛养木杆菌诱导的葡萄防卫相关基因在生物过程和分子功能方面具有很大的相似性,而在细胞组分上具有较大的差别,而且不同的接种方法诱导的马铃薯青枯病防卫相关基因有很大的差异;青枯菌小菌落变异株不能诱导nsLTP基因的上调表达表明了该基因的表达与青枯菌的致病性有关。这些实验结果为进一步大范围基因表达分析、深入研究青枯病防卫机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 马铃薯-青枯菌互作及相关研究进展
• 1.1.1 病原
• 1.1.2 寄主
• 1.1.3 相互作用
• 1.1.4 病害管理
• 1.1.5 问题与展望
• 1.2 本论文的研究内容与目的及拟解决的关键问题
• 第二章 青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因的筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 植物材料与菌种
• 2.2.2 总RNA 抽提
• 2.2.3 cDNA 反转录
• 2.2.4 cDNA Rsa I 酶切
• 2.2.5 cDNA Rsa I 酶切产物的接头连接
• 2.2.6 第一轮差减杂交
• 2.2.7 第二轮差减杂交
• 2.2.8 PCR 扩增反应
• 2.2.9 差减文库克隆
• 2.2.10 反向Northern 斑点杂交
• 2.2.11 RT-PCR 验证
• 2.2.12 序列分析和功能注释
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 青枯菌PO41在马铃薯中的居群动态
• 2.3.2 SSH 文库构建
• 2.3.3 差异表达片段的RT-PCR 验证
• 2.3.4 序列测定与同源检索及GO 分类
• 2.4 讨论
• 2.4.1 SSH-EST 克隆的有效性和局限性
• 2.4.2 GO 术语注释和分类防卫相关基因功能的准确性
• 2.4.3 青枯病防卫反应中部分关键基因的分子功能
• 2.4.4 关于青枯菌诱导的防卫相关基因参与的生物学通路
• 2.4.5 比较两种细菌性维管束病害中寄主EST揭示了防卫相关基因的异同
• 2.4.6 两种不同诱导方法揭示的青枯病防卫相关基因的异同
• 2.5 结论
• 第三章 StLTPa7 基因在马铃薯与青枯菌互作早期的表达模式
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料、菌种与接种
• 3.2.2 富集青枯菌诱导表达马铃薯cDNA文库的构建
• 3.2.3 化学处理
• 3.2.4 马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7cDNA 全长的获得
• 3.2.5 序列测定和生物信息学分析
• 3.2.6 Real-Time PCR、RT-PCR 和Northern 杂交
• 3.2.7 环境扫描电子显微镜和EDAX 能谱分析
• 3.2.8 原位杂交
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 富集马铃薯与青枯菌互作早期诱导表达的防卫相关基因的cDNA文库
• 3.3.2 StLTPa7 cDNA 的克隆、结构与进化分析
• 3.3.3 青枯菌诱导StLTPa7 基因的时空表达
• 3.3.4 EDAX 分析和氯化钙诱导的StLTPa7 基因的表达
• 3.3.5 非生物激发子对StLTPa7 基因表达的诱导效应
• 3.3.6 钌红对StLTPa7 基因表达的抑制效应
• 3.3.7 StLTPa7 基因表达的原位杂交定位
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于马铃薯与青枯菌互作早期诱导表达的防卫相关基因的cDNA文库
• 3.4.2 StLTPa7 基因的结构与抗病性功能
• 3.4.3 青枯菌和非生物激发子诱导的StLTPa7 基因上调表达与防卫反应
• 3.4.4 StLTPa7 基因转录的时空特征表明其可能参与系统获得抗性
• 3.4.5 StLTPa7 基因可能涉及一种复杂的Ca2+ 相关的基因表达模式
• 3.4.6 StLTPa7 作为防卫基因参与马铃薯青枯病抗性的机制探讨
• 3.5 结论
• 第四章 StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的差异表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料和青枯菌株
• 4.2.2 化学处理
• 4.2.3 RNA/DNA 制备
• 4.2.4 抑制差减杂交和序列分析
• 4.2.5 分离全长nsLTP cDNA
• 4.2.6 Real-Time PCR、RT-PCR 和Northern 杂交
• 4.2.7 组织原位杂交
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 克隆和鉴定StLTPa1 基因
• 4.3.2 青枯菌诱导StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的表达模式
• 4.3.3 StLTPa1 基因表达受非生物激发子的影响
• 4.3.4 StLTPa1 基因表达的组织定位
• 4.4 讨论
• 4.4.1 StLTPa1 基因结构与进化
• 4.4.2 青枯菌诱导StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的表达模式
• 4.4.3 StLTPa1 基因的表达受非生物因子的影响
• 4.4.4 StLTPa1 基因与StLTPa7 的关系
• 4.5 结论
• 第五章 潜伏感染菌株不能诱导 StLTPa7 和 StLTPa1 基因的表达
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 青枯菌、植物材料和生长条件
• 5.2.2 SCV 菌株的分离
• 5.2.3 生理检测
• 5.2.4 分子鉴定
• 5.2.5 电镜检测
• 5.2.6 致病性检测
• 5.2.7 StLTPa7 和StLTPa1 基因表达检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 青枯菌R.solanacearum SCVs的特征
• 5.3.2 青枯菌R. solanacearum SCVs的鉴定
• 5.3.3 StLTPa7 基因表达的检测
• 5.4 讨论
• 5.4.1 分离的两株低温适应型青枯菌归属于小菌落变异株更为合理
• 5.4.2 SCV 不诱导寄主防卫基因表达是逃避寄主免疫系统的一种表现？
• 5.4.3 小菌落变异株对马铃薯寄主无症状潜伏感染
• 5.4.4 小菌落变异株有利于青枯菌种内进化
• 5.4.5 关于青枯病的发生和流行
• 5.5 结论
• 第六章 其他防卫相关基因cDNA 克隆与序列分析
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 青枯菌、植物材料和生长条件
• 6.2.2 马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导表达基因的SSH cDNA 文库
• 6.2.3 富集马铃薯青枯病防卫早期表达基因cDNA 文库
• 6.2.4 防卫相关基因cDNA 全长的获得
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 全长cDNA 的克隆
• 6.3.2 五条马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因的关系
• 6.3.3 马铃薯青枯病防卫反应中的铁蛋白
• 6.3.4 马铃薯青枯病防卫反应中的印膜蛋白
• 6.3.5 马铃薯青枯病防卫反应中的开心蛋白
• 6.3.6 马铃薯青枯病防卫反应中的蛋白酶抑制子
• 6.3.7 马铃薯青枯病防卫反应中的转录因子
• 6.4 结论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历