论文摘要
在植物转基因的这一领域内，大豆是较难转化的作物之一，这是由于大豆组织培养再生困难，可重复性差，基因型之间差异大，遗传转化体系是完全根据大豆的基因型所建立的。本试验通过大豆子叶节器官发生途径的再生系统，从福建地域生态型的10个不同大豆基因型中筛选到再生频率高的一个基因型，并对影响再生频率和农杆菌介导的遗传转化系统的主要因素进行了优化，建立了一个适于农杆菌转化的大豆子叶节高效受体系统，并在此基础上进行了LEAFY和Hslpro-1基因的初步遗传转化研究。主要研究结果如下：1．大豆基因型和基本培养基的筛选选择福建地域生态型的10个不同基因型大豆品种分别在MS和B5基本培养基中，进行出苗培养和丛芽培养，结果表明，在激素浓度相同的情况下，出苗率和再生频率在MS和B5这两种培养基之间的差异不大，但在基因型之间差异较大，特别是上杭六月泡的出苗率和再生频率均高于其它基因型，分别是达到43.5％和70％。2．子叶节不定芽诱导分化的激素浓度的筛选（1）本试验在子叶节不定芽诱导分化阶段设计了BA和IBA浓度梯度交互配比的方案，筛选到对于上杭六月泡这个基因型大豆BA和IBA的最适配比浓度，分别为1.4mg/L和0.2mg/L，再生频率为78.95％（2）研究表明大豆生根阶段施加IBA可以显著提高生根率，生根基本培养基为1／2MS，蔗糖浓度为2％，筛选得到在IBA浓度为2mg／L、BA浓度为0.2mg／L时，生根率较高，为75.56％。3．影响农杆菌遗传转化效率的因素筛选（1）由于在LEAFY和Hslpro-1基因真核表达载体中所携带的选择标记基因皆为NPTⅡ，本研究以Kan为选择剂。将大豆子叶节接入不同Kan浓度水平的培养基进行筛选，结果表明，Kan筛选浓度为150mg／L。（2）本研究以不同浓度的TIMENTIN为杀菌剂，结果表明，浓度在0-300mg／L之间对大豆子叶节的生长以及不定芽的化化无较大的影响，在外植体与农杆菌共培养后，在液体培养基和固定培养基中，浓度分别为75mg／L和250mg／L的TIMENTIN浸泡30min，可完全抑制农杆菌的生长。（3）农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，用GUS瞬时表达率来衡量侵染和共培养的最适时间。研究表明侵染时间为15min，共培养时间为80h，GUS的瞬时表达率最高，为23.5％。因此，本研究以15min的侵染时间和80h的共培养时间为最佳配比时间。4．阳性植株PCR检测利用PCR法分别对转LEAFY和Hslpro-1基因的转化苗进行检测，分别获得阳性的转基因植株为2株和3株，转化频率分别为0.76％和1.11％。5．阳性植株的Southern杂交检测以LEAFY和Hslpro-1基因片段为探针，对转基因阳性植株进行Southern杂交，结果表明转化体中均含有整合的外源基因。