论文摘要
背景与目的支气管哮喘是儿童最常见的慢性疾病之一,以气道淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等多种炎症细胞浸润、气道高反应性为特征。在过去的三十年中,哮喘等变应性疾病在世界范围内明显增加。尽管遗传因素与哮喘发生明确相关,由于人类遗传背景短期内不可能发生明显变化,哮喘发病率明显增加可能是环境因素改变的结果,这也正是“卫生假说”的观点。以往研究认为哮喘免疫学发病机制与Th1/Th2细胞功能失衡密切相关。近年来,调节性T细胞（Tr）功能在哮喘发病中的作用引起了人们广泛关注,最新的观点认为Th1/Th2/Treg模式能更好解释哮喘发病机制。如何在小儿免疫系统功能早期发育过程中应用某些药物或微生物制剂予以适当干预与调节,通过影响T细胞亚群发育,特别是促进Th1/Tr发育,具有重要意义。我们前期研究发现哮喘患儿存在CD4+CD25+Tr细胞数量减少及分化发育障碍,Foxp3基因表达降低;动物实验中新生期BCG接种能诱导Th1/Tr反应,能减轻小鼠实验性哮喘的气道高反应性（AHR）和气道炎症;但RSV感染也诱导Th1应答却能逆转BCG的抗哮喘作用。在前期研究基础上,我们提出以下假设:1)作为哮喘干预防治的一线药物,糖皮质激素可能通过某些细胞因子信号通路而影响哮喘患儿体内CD4+Foxp3+T细胞达到控制气道炎症,降低气道高反应性的目的。2)通过将Poly I:C与BCG联合或将IL-12与BCG重组早期接种可能增强BCG诱导Th1/Tr免疫反应,减少哮喘等变应性疾病的发生或程度。我们从临床和动物实验的角度对其分三部分进行了初步探讨:第一部分糖皮质激素对哮喘儿童外周血Foxp3+调节性T细胞及IL-2、IL-6的影响及其机制研究目的:研究吸入丙酸氟替卡松（FP）对哮喘患儿外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+Foxp3+调节T细胞、细胞因子IL-2、IL-6以及转录因子STAT5的影响和体外地塞米松（Dex）对正常人外周血PBMC中上述指标的影响。方法:以30例确诊哮喘患儿为研究对象,随机分为未治疗哮喘组（15例）、吸入FP缓解组（15例）,同期10例正常儿童为对照组。另选6例正常儿童用于体外研究,每例儿童PBMC分为空白组、Dex组、PHA组及PHA+Dex组4组。流式细胞仪检测外周血PBMC中的CD4+Foxp3+调节T细胞比率,ELISA检测血浆或培养上清中IL-2、IL-6细胞因子水平,Western blot检测PBMC中磷酸化（p-STAT5）非磷酸化STAT5的水平。结果:（1）未治疗哮喘组PBMC中CD4+Foxp3+Tr细胞百分率在PHA刺激培养前后均明显低于正常对照组,吸入FP缓解组明显升高,与正常对照组没有差异;各组刺激后CD4+Foxp3+Tr细胞百分率均有升高,吸入FP缓解组、正常对照组分别升高约1.89、2.01倍,而未治疗哮喘组升高仅1.56倍。（2）未治疗哮喘组血浆中IL-6水平明显高于正常组及吸入FP缓解组,而IL-2水平没有明显差异。（3）正常人PBMC在体外PHA刺激后CD4+Foxp3+Tr细胞数增加明显,IL-2、IL-6也明显增加;加入Dex后均明显下降。（4）PHA刺激后未治疗哮喘组磷酸化STAT5（p-STAT）表达水平明显低于吸入FP组及正常对照组,而各组STAT5表达水平没有明显差异;（5）体外Dex能明显抑制PHA对STAT5的活化作用,降低p-STAT5水平。结论:吸入FP增加哮喘患儿外周血CD4+Foxp3+Tr细胞数量,其机制可能与降低血浆IL-6,上调STAT5水平有关;体外Dex干预能抑制PHA对CD4+Foxp3+Tr细胞的上调作用,可能与促进IL-6和降低STAT5活性有关。不同糖皮质激素对CD4+Foxp3+Tr细胞的影响不同,其机制有待进一步研究。第二部分卡介苗联合Poly I∶C新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育及实验性哮喘的影响目的:研究卡介苗（BCG）联合Poly I:C新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育及实验性哮喘的影响。方法:（1）新生清洁级BALB/c小鼠32只,分4组:对照组、BCG组、Poly I:C组、BCG和Poly I:C联合接种组,新生期接种4周后取脾细胞用流式细胞仪检测Tc1、Th1、Tc2、Th2和Tr细胞亚群。（2）新生清洁级BALB/c小鼠40只,分5组:对照组、鸡卵蛋白（OVA）组、BCG+OVA组、Poly I:C+OVA组、BCG+ Poly I:C+OVA组,新生期接种4周后,除对照组外均进行OVA致敏和激发。最后一次激发后进行支气管肺泡灌洗,瑞氏染色观察支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞数及分类,ELISA检测BALF中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10含量和血清中OVA特异性IgE水平,肺组织HE染色进行气道炎症病理分析。结果:（1）BCG组、Poly I:C组、BCG+Poly I:C组脾脏指数、Th1、Tc1细胞比例均明显高于对照组（P<0.05或P<0.01）,三组间比较没有显著性差异;Tc2、Th2和CD4+Foxp3+Tr细胞比例各组间比较没有显著性差异;三接种组Th1/Th2和总IFN-γ/IL-4比值明显高于对照组（P<0.05或P<0.01）,BCG+Poly I:C组Th1/Th2比值高于BCG组（P<0.05）,Tc1/Tc2比值各组间没有差异;CD4+Foxp3+Tr细胞比例各组间比较没有显著性差异。（2）动物行为学观察表明各哮喘组小鼠均出现明显的动物哮喘发作表现;与对照组比较,各哮喘组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞均明显增加（P<0.01）,BCG+OVA组、BCG+Poly I:C+OVA组与OVA组或Poly I:C+OVA组相比明显降低（P<0.05）,二组间比较无明显差异;各哮喘组BALF中IFN-γ水平明显低于对照组（P<0.01）,IL-4水平明显增高（P<0.01）,IL-10水平明显降低（P<0.01）,IgE水平明显增高（P<0.01）。BCG+OVA组和BCG+PolyI:C+OVA组分别与OVA组或PolyI:C+OVA组比较IFN-γ明显增高（P<0.05或P<0.01）,IgE水平明显降低（P<0.05）,BCG+OVA组和BCG+PolyI:C+OVA组比较、PolyI:C+OVA组与OVA组比较IFN-γ、IL-4、IgE水平均没有明显差异（P>0.05）。IL-4、IL-10水平各哮喘组相互两两比较没有明显差异（P>0.05）;各哮喘组小鼠毛细支气管周围炎症、血管周围炎症、肺泡炎症病理评分显著高于对照组（P<0.05）。BCG+OVA组、BCG+PolyI:C+OVA组毛细支气管周围炎症、血管周围炎症、肺泡炎症均明显低于OVA组和PolyI:C+OVA组（P<0.05）,但二组间比较无明显差异,PolyI:C+OVA组与OVA组比较没有明显差异。结论:Poly I:C新生期接种与BCG一样能诱导Th1/Tc1免疫应答,但不能降低血清IgE水平,减轻哮喘小鼠气道炎症,不具有BCG接种的抗哮喘效应,与BCG联合接种亦无协同效应,提示病毒诱导的Th1/Tc1与BCG等病原体诱导的Th1/Tc1应答对哮喘的影响不同。第三部分IL-12+重组卡介苗新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育及实验性哮喘的影响目的:研究IL-12+重组卡介苗（r-BCG）新生期接种对小鼠脾脏T细胞功能亚群发育及实验性哮喘的影响。方法:（1）新生清洁级BALB/c小鼠32只,分4组:对照组、BCG组、r-BCG和IL-12+穿梭质粒（M12）接种组,新生期接种4周后取脾细胞用流式细胞仪检测Tc1、Th1、Tc2、Th2和CD4+Foxp3+Tr细胞亚群。（2）新生清洁级BALB/c小鼠40只,分5组:对照组、OVA组、BCG+OVA组、r-BCG+OVA组、M12+OVA组,新生期接种4周后除对照组外均进行OVA致敏和激发。最后一次激发后进行支气管肺泡灌洗,瑞氏染色观察BALF中白细胞数及分类,ELISA检测BALF中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10含量和血清中OVA特异性IgE水平,肺组织HE染色进行气道炎症病理分析。结果:（1）BCG组、r-BCG组脾脏指数、Th1、Tc1细胞比例、Th1/Th2和总IFN-γ/IL-4比值均明显高于对照组和M12组（P<0.05或P<0.01）,二接种组间比较没有显著性差异;Tc2、Th2和CD4+Foxp3+Tr细胞比例各组间比较没有显著性差异;（2）动物行为学观察表明各哮喘组小鼠出现明显的动物哮喘发作表现;各哮喘组小鼠BALF中细胞总数、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞较对照组均明显增加（P<0.01）,BCG组、r-BCG组与OVA组或M12+OVA组相比明显降低（P<0.05）,二组间比较无明显差异;各哮喘组分别与对照组比较BALF中IFN-γ水平明显降低（P<0.01）,IL-4水平明显增高（P<0.01）,IL-10水平明显降低（P<0.01）,血清IgE水平明显增高（P<0.01）。BCG+OVA组和r-BCG+OVA组分别与OVA组和M12组比较,BALF中IFN-γ明显增高（P<0.05或P<0.01）,IgE水平明显降低（P<0.05）,但BCG+OVA组和r-BCG+OVA组相互比较没有明显差异,M12+OVA组与OVA组比较没有明显差异,各哮喘组IL-4、IL-10水平无明显差异。各哮喘组分别与对照组比较细支气管周围炎症、肺间质炎症、血管周围炎症明显增加（P<0.01）。BCG组、r-BCG组分别与OVA组、M12+OVA组比较支气管细支气管周围炎症、肺间质炎症、血管周围炎症均有明显减轻（P<0.05）,r-BCG组在支气管细支气管周围炎症、肺间质炎症程度上比BCG组有明显降低（P<0.05）。结论:IL-12+重组BCG新生期接种能降低哮喘小鼠血清IgE水平,减轻气道变应性炎症,能够对OVA诱导哮喘小鼠模型产生一定的预防作用。r-BCG在减轻哮喘小鼠气道炎症上优于BCG,其机制可能并非单纯通过促进Th1/Tc1免疫应答达到增强BCG抗哮喘效应,可能还有其他机制参与。