呼吸道合胞病毒亚单位疫苗的研究

论文摘要

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）属副黏病毒科,肺炎病毒属,为非节段性的负链RNA病毒。RSV基因组有15,222个核苷酸,主要编码10个特异性蛋白,其中膜表面的融合蛋白F和粘附蛋白G是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒表面抗原,是疫苗研究开发的重要内容。呼吸道合胞病毒（RSV）广泛流行于世界各地,是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的病原微生物之一。世界卫生组织（WHO）已将RSV疫苗列为全球疫苗计划中优先发展的疫苗之一。RSV疫苗研制虽已有40年历史,但至今尚无被批准使用的疫苗。为此,本研究利用杆状病毒昆虫表达系统表达了RSV全长的F、G蛋白,免疫Balb/c小鼠,评价了F和G全长蛋白疫苗的免疫原性和有效性。运用生物信息学软件选择F205～223,255～278,G142～204位氨基酸作为研究对象,表达并纯化了F-G融合表位蛋白。该研究为进一步研制适合我国的RSV疫苗奠定了试验基础。RSV F和G全长重组蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化目的表达并纯化RSV Long株F和G全长蛋白。方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）克隆了RSV A型Long株的全长F和G基因,构建了F-pFastHT A和G-pFastHT A质粒。将阳性重组质粒分别转化DH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒质粒F-Bacmid和G-Bacmid。将其转染昆虫细胞,成功包装了含有目的片段的重组杆状病毒,采用Ni2+离子亲和层析柱纯化了接毒细胞的表达产物。进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验鉴定重组蛋白。结果目的蛋白F和G在昆虫细胞中有特异性表达, Ni2+离子亲和层析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆了RSV F和G基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白的纯度达85%以上,可用于免疫Balb/c小鼠。RSV F和G全长重组蛋白和表位肽疫苗免疫效果的研究目的检测RSV F和G蛋白候选疫苗的免疫原性和安全性。方法选用Mf59分别与F、G蛋白配制疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠;弗氏佐剂与F和G蛋白配制疫苗肌肉注射免疫Balb/c小鼠做为对照。分别采用间接ELISA法和微量中和试验检测免疫鼠血清特异性IgG和中和抗体效价;间接ELISA法检测免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性IgG和SIgA抗体效价;MTT法检测免疫鼠脾淋巴细胞增殖;ELISPOT法检测免疫鼠脾脏淋巴细胞γ-IFN、IL-2、IL-4分泌。结果经杆状病毒昆虫表达系统表达的RSV F和G全长蛋白在Balb/c小鼠体内诱导产生了高滴度的血清IgG抗体、中和抗体和肺局部抗体,其中F蛋白疫苗诱导产生了平衡的IgG1/IgG2a。结论RSV F蛋白可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;G蛋白疫苗只刺激机体产生体液免疫,并引起Th2优势应答。RSV F-G表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化目的选择能同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫并诱导平衡的Th1/Th2应答的RSV表位蛋白。方法运用生物信息学软件预测F和G蛋白的空间结构,并查看资料寻找F和G蛋白的抗原表位。选择F205～223,255～278,G142～204位氨基酸作为研究对象,合成编码这两段表位的基因,采用重叠PCR将编码F和G两段表位的基因连接,杆状病毒昆虫表达系统表达F-G融合表位肽蛋白,Ni2+亲和层析纯化目的蛋白。结果融合表位蛋白F-G在昆虫细胞中有特异性表达, Ni2+离子亲和层析柱能够很好的吸附重组目的蛋白。结论成功克隆了RSV F-G融合表位基因,并在Sf9昆虫细胞中获得表达。Ni2+离子亲和层析法纯化目的蛋白的纯度达85%以上。

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摘要

Abstract

引言

1. RSV 的生物学特性和流行病学

2. RSV 感染的免疫病理

3. RSV 感染的治疗

4. 预防 RSV 感染的疫苗研究

4.1 福尔马林灭活疫苗

4.2 亚单位疫苗

4.3 减毒活疫苗

4.4 病毒载体疫苗

4.5 基因工程疫苗

4.6 核酸疫苗

5. 杆状病毒表达系统

5.1 杆状病毒的生物学特性

5.2 杆状病毒表达系统组成

5.2.1 供体质粒

5.2.2 穿梭载体质粒

5.2.3 昆虫细胞

5.3 杆状病毒昆虫表达系统的原理

5.4 杆状病毒昆虫表达系统技术路线

6. 本研究的目的和意义

第一章 RSV F 和 G 全长蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化

1. 材料

1.1 毒株和细胞

1.2 主要药品与试剂

1.3 引物设计

1.4 试验仪器

1.5 溶液的配置

1.5.1 主要缓冲液

1.5.2 培养基

1.6 分子生物学分析软件

2. 方法

2.1 呼吸道合胞病毒的培养

2.1.1 培养 Vero 细胞

2.1.1.1 Vero 细胞复苏

2.1.1.2 Vero 细胞的继代培养

2.1.1.3 细胞准备

2.1.2 培养 RSV

2.2 总提 RSV 病毒 RNA

2.2.1 准备

2.2.2 总提 RNA

2.3 RT-PCR

2.3.1 反转录

2.3.2 PCR

2.3.3 琼脂糖凝胶电泳

2.4 目的片段与 T 载体的连接

2.4.1 目的片段的胶回收纯化

2.4.2 回收 PCR 产物分别与 T 载体连接

2.4.3 连接产物的转化

2.4.4 重组质粒的鉴定

2.4.4.1 重组质粒的 PCR 扩增鉴定

2.4.4.2 重组质粒的酶切鉴定

2.4.4.3 重组质粒的测序

2.5 目的片段与表达载体连接

2.5.1 目的片段酶切回收纯化

2.5.2 载体质粒的酶切回收

2.5.3 目的片段与表达载体的连接

2.5.4 连接产物的转化

2.5.5 重组质粒的鉴定

2.5.5.1 重组质粒的 PCR 扩增鉴定

2.5.5.2 重组质粒的酶切鉴定

2.5.5.3 重组质粒的测序

2.6 阳性质粒的同源重组

2.7 同源重组质粒的菌落 PCR 鉴定

2.8 分离重组质粒 F-Bacmid 和 G-Bacmid DNA

2.9 分析重组质粒 Bacmid DNA

2.9.1 用琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒 DNA

2.9.2 用 PCR 分析重组质粒 Bacmid DNA

2.10 Sf9 昆虫细胞培养

2.10.1 Sf9 昆虫细胞的复苏

2.10.2 Sf9 昆虫细胞的传代

2.10.3 昆虫细胞的冻存

2.11 细胞转染

2.12 收获重组杆状病毒

2.13 PCR 鉴定重组杆状病毒

2.14 空斑试验测定病毒效价

2.15 重组杆状病毒的扩增

2.16 重组蛋白的表达

2.17 重组蛋白表达的检测

2.17.1 SDS-PAGE

2.17.2 间接免疫荧光法检测表达蛋白

2.17.3 重组蛋白的 Western-blot 检测

2+亲和层析法纯化目的蛋白'>2.18 Ni²⁺亲和层析法纯化目的蛋白

3. 结果

3.1 Vero 细胞培养 RSV Long 的细胞病变

3.2 RT-PCR 扩增 F 和 G 基因片段的电泳结果

3.3 目的片段连 T 载体菌落 PCR 和酶切鉴定结果

3.4 目的片段与pFastHT A 载体连接菌落 PCR 和酶切鉴定结果

3.5 同源重组菌落 PCR 结果

3.6 分析重组质粒 Bacmid DNA 结果

3.7 转染 Sf9 细胞结果

3.8 空斑试验结果

3.9 蛋白表达结果

2+亲和层析纯化目的蛋白结果'>3.10 Ni²⁺亲和层析纯化目的蛋白结果

4. 小结与讨论

第二章 RSV F 和 G 全长蛋白疫苗免疫效果的研究

1. 材料

1.1 毒株和细胞

1.2 主要试剂与仪器

1.3 实验动物

1.4 主要试剂的配制

2. 方法

2.1 RSV A 型 Long 株病毒的培养

2.2 RSV Long 病毒滴度测定

2.3 纯化的 F、G 蛋白候选疫苗免疫动物

2.3.1 配制 F、F/Mf59、F/弗氏佐剂重组蛋白疫苗免疫动物

2.3.2 配制 G、G/Mf59、G/弗氏佐剂重组蛋白疫苗免疫动物

2.4 免疫鼠血清特异性 IgG 抗体效价检测

2.5 免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 IgG 和 SIgA 检测

2.5.1 免疫鼠肺灌洗液的制备

2.5.2 免疫鼠鼻灌洗液的制备

2.5.3 免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 IgG 检测

2.5.4 免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 SIgA 检测

2.6 免疫鼠血清特异性 IgG1 和 IgG2a 检测

2.7 免疫鼠血清中和抗体滴度检测

2.8 脾脏淋巴细胞制悬液备

2.9 免疫鼠 T 淋巴细胞增殖检测

2.10 脾脏细胞γ-IFN、IL-2、IL-4 分泌的检测

2.11 数据处理

3. 结果

3.1 RSV 病毒滴度

3.2 免疫鼠血清抗体效价

3.3 免疫鼠肺、鼻灌洗液 IgG 抗体效价

3.4 免疫鼠肺、鼻灌洗液 SIgA 抗体效价

3.5 免疫鼠血清特异性 IgG1 和 IgG2a 效价

3.6 免疫鼠血清中和抗体滴度

3.7 免疫鼠 T 淋巴细胞增殖检测结果

3.8 免疫鼠脾脏分泌γ-IFN、IL-2、IL-4 的淋巴细胞数

3.8.1 免疫鼠脾脏分泌γ-IFN 的淋巴细胞数

3.8.2 免疫鼠脾脏分泌 IL-2 的淋巴细胞数

3.8.3 免疫鼠脾脏分泌 IL-4 淋巴细胞数

4. 小结与讨论

4.1 体液免疫效果评价

4.2 细胞免疫效果评价

4.3 黏膜免疫效果评价

第三章 RSV F-G 蛋白表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化

1. 材料

1.1 生物信息学软件预测 F 和 G 蛋白表位

1.2 F 和 G 蛋白表位基因序列的合成

1.3 质粒

1.4 引物设计

2. 方法

2.1 PCR 扩增 F 和 G 串联表位基因

2.2 重叠 PCR 扩增 F-G 串联表位基因

2.3 重组质粒 F-G-T、F-G-pFastHT A 的酶切鉴定

3. 结果

3.1 PCR 扩增 F 串联表位基因和 G 片段串联表位基因电泳结果

3.2 重叠 PCR 扩增 F-G 串联表位基因的电泳结果

3.3 F-G 串联表位基因连 T 载体菌落 PCR 和双酶切结果

3.4 F-G 串联表位基因与pFastHT A 连切接菌落 PCR 和双酶切结果

3.5 同源重组菌落 PCR 结果

3.6 分析重组质粒 Bacmid DNA 结果

3.7 转染 Sf9 细胞结果

3.8 空斑试验结果

3.9 蛋白表达结果

3.10 目的蛋白纯化结果

4. 小结与与讨论

全文讨论

结论

致谢

参考文献

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