论文摘要
鸡胚胎原始生殖细胞（Embryonic Primordial Germ Cells,EPGCs）是形成精子和卵子的祖先细胞,在饲养细胞层和多种生长因子的共同作用下,可成为长期增殖并维持不分化状态的多能性干细胞。本研究以第19期发育的鸡EPGCs为实验材料,以增强性绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP）为报告基因,比较了不同转染方法对鸡EPGCs的转染效率,并对电穿孔转染条件进行了比较和优化;同时,通过细胞毒性敏感实验确立快速筛选转基因阳性细胞的G418（氨基糖甙类新霉素衍生物,Geneticin）适合量,进行体外快速筛选转染细胞的探索,并尝试将筛选后的阳性EPGCs通过显微注射法注入囊胚期胚盘中生产转基因鸡,为利用EPGCs介导生产转基因鸡提供参考依据。实验结果如下:1.采用磷酸钙转染法、脂质体转染法、电穿孔转染法和磷酸钙甘油休克法等4种方法,以EGFP为报告基因,对19期第2代的鸡EPGCs进行转染,结果表明,电穿孔转染率最高,为17.096%;磷酸钙甘油休克法转染率次之,为12.554%;磷酸钙转染法转染率为7.866%;脂质体转染法的转染率最低,为1.138%。2.以EGFP为报告基因,电穿孔转染19期第2代鸡EPGCs,比较电压、脉冲时程、质粒浓度和温度等因素对转染率的影响。结果显示:（1）当电压分别为180V、230V、280V、330V和380V时,转染率分别为12.520%、14.408%、18.635%、17.944%和13.765%,转染率在280V时最高,与除330V以外的其它电压下的转染率存在极显著的差异（P<0.01）;（2）当脉冲时程分别为40μs、60μs、80μs和100μs时,转染率分别为12.520%,16.143%,14.715%和12.368%,转染率在60μs时最高,与其它脉冲时程下的转染率之间均存在极显著的差异（P<0.01）;（3）当质粒浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL时,转染率分别为8.300%、12.520%、17.948%和17.577%,转染率在质粒浓度为15μg·mL-1时最高,与除20μg·mL-1之外的其它浓度下的转染率差异极显著（P<0.01）;（4）当作用的温度分别为25℃和4℃时,转染率分别为12.520%和4.634%,两者之间存在极显著差异（P<0.01）。3.为了确定EPGCs对G418的耐受能力,获得快速筛选EPGCs的G418适宜量,本研究对EPGCs进行了细胞毒性敏感实验。结果表明:EPGCs分别在G418浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL和600μg/mL的培养液中培养时,可存活时间分别为15d、14d、10d、8d、5d和3d。用含有G418浓度为400μg/mL的培养基,对转染48h后的EPGCs进行快速筛选,结果在筛选第6d时,出现EPGCs阳性克隆,筛选第8d时,非阳性细胞全部死亡。4.以EGFP为报告基因,电穿孔转染,筛选8d后阳性EPGCs注射到鸡胚中,进行转基因鸡制备的初步尝试。结果显示:注射112枚受精蛋,孵化发育至15d时全部死亡。对孵化后1-7胚龄的死亡全胚及8-15胚龄死亡鸡胚的肌肉、肝脏、心脏和肾脏组织进行PCR检测,结果表明,孵化后1d-3d和4d-7d时,全胚DNA的PCR阳性率分别为52.63%和31.58%,8d-11d的阳性率为20.00%,12d-13d的阳性率为10.00%,14d-15d的阳性率为5.56%,阳性率随孵化日龄的增加呈逐渐降低趋势。5.对转基因鸡胚的肌肉、肝、心脏和肾脏组织制作冰冻组织切片,结果发现荧光表达强弱在不同组织中存在差异,在肝脏、心脏和肾脏中表达较高,在肌肉组织中表达较弱。
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标签：胚胎原始生殖细胞论文; 增强性绿色荧光蛋白论文; 转染论文; 筛选论文;