软骨保护剂对原发性骨关节炎影响的实验研究

论文摘要

原发性骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种以关节软骨丢失为主要特征的骨关节进行性的退变,为中老年最常见的疾病,50岁以上人群的发病率在50%以上。OA的临床症状主要为关节的疼痛、僵直、关节功能减退、活动能力降低和肌无力。随着OA病情的发展,患者的生活质量将不断下降,同时也给社会的医疗、福利保障体系带来负担。OA的预防和治疗越来越受到人们的关注。目前治疗OA的原则是:1)缓解疾病的症状,2)控制疾病的发展,并且3)在减轻疼痛和恢复功能的同时,避免不良反应。治疗OA的药物主要有止痛剂和非甾体抗炎药（NSAIDs）。虽然这些药物可以改善OA的症状,但同时,它们能引起严重的消化道和心血管系统的不良反应,而且对防止软骨结构的改变并无作用。OA更需要一种“标本兼顾”的治疗方法。为此,软骨保护剂,特别是硫酸氨基葡萄糖（Glucosamine sulfate,GS）和硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）被广泛地运用到OA的预防和治疗中。作为软骨的组成成分,GS和CS可以通过影响软骨细胞外基质（Extracelluar matrix,ECM）中胶原和蛋白多糖（Proteoglycan,PG）的合成,调控炎症通路,继而发挥抑制软骨退变的作用。在欧洲GS和CS被作为处方药,可以单独或联合使用,而在美国它们仅作为营养补充剂,可以在市场上自由销售。造成这两种不同用途和管理方式的原因可能与经过20多年的研究,结果仍无定论有关。GS和CS的临床试验多采用随机、双盲、安慰剂对照的方法,虽然已经获得了许多有说服力的证据,证明GS和CS具有缓解疼痛和改善骨关节功能的作用,但在试验中,往往以患者的自我评价作为观察终点,势必给试验结果有效和无效的判断带来困难。体外试验也显示,GS和CS可以影响软骨复杂的生物代谢因子,其中包括与软骨结构和炎症通路有关的蛋白水解酶,细胞因子及其受体,使之发挥保护软骨组织的作用。但在体外试验中使用的GS和CS的浓度大大超过了人体通常口服的,用于临床治疗OA或营养补充时的剂量。将体外试验的结果外推到人,仍有很大的差距。目前,利用OA的动物模型来评价GS和CS效果的报道很有限,而临床研究仍缺乏敏感性强且特异的诊断手段,可供体外试验的患病组织又不容易获取,因此对于OA的研究,动物试验还是十分有价值的。在评价对于OA症状和软骨结构都可能有作用的软骨保护剂时,寻找和了解与人类OA发生相似的动物模型和动物品系十分重要。为了给GS和CS的研究提供更多有价值的数据,本研究分别采用了不同的炎症、疼痛和自发OA动物模型,就GS、CS和两者联合使用对缓解OA症状和维持软骨结构的作用进行了探讨。在抗炎试验中:经过30天的经口给药,无论是GS组（1g/kg.BW GS）,CS组（0.5g/kg.BW CS）还是两者的联合使用组（1g/kg.BW GS+0.5g/kg.BW CS）都能快速地减轻由二甲苯引起的小鼠诱导4h后的耳朵肿胀,以及由酵母引起的大鼠诱导1h,6h,24h和72h后的足跖肿胀,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.001）。试验结果提示:GS和CS可以通过调控炎症通路来抑制动物急性和亚急性的炎症反应。在镇痛试验中,采用与抗炎试验相同的实验剂量和处理方法后,与对照组相比,GS组、CS组和联合使用组都能延长55℃热板试验中小鼠舔后足跖的痛反应时间,减少由醋酸诱导后15min内小鼠的扭体次数（P＜0.001）。三个试验组都具有一定的镇痛作用。GS和CS的镇痛作用可能是通过抑制炎症反应表现出来的。远交繁殖的Hartley豚鼠自发的膝关节进行性的退变与人类OA的发展十分相似。在应用这一模型之前,我们研究了不同年龄阶段Hartley豚鼠膝关节软骨的结构和成分的变化规律。研究分别采用H.E,Alcain Blue、PAS和Mallory染色对0.5月龄至6月龄的豚鼠膝关节软骨的结构和成分的变化进行了组织病理学检测,同时采用ELISA法测定了血清中PG的含量。结果发现,在雌性Hartley豚鼠中,0.5月龄和1月龄的豚鼠,关节软骨的结构以及PG和胶原的含量都处于正常范围;2月龄的豚鼠发生了OA的早期改变;3月龄和4月龄的豚鼠发生了中等程度的OA改变而5月龄和6月龄的豚鼠发生了严重的OA改变。这些组织病理学的改变包括不同程度的软骨细胞的死亡和减少,PG的丢失以及不断向软骨表层、移行层和辐射层扩展的组织纤维化。但在雄性Hartley豚鼠中并没有观察到类似的组织病理学的进行性改变,从0.5月龄到6月龄的雄性Hartley豚鼠仅观察到了轻微的OA组织病理学改变。雄性豚鼠血清中PG的水平总体比雌性的高,但随着年龄的增长,无论是雄性还是雌性的豚鼠,血清PG的含量都在不断地下降。此外,1月龄时,与同性别其它月龄相比,血清PG含量下降的幅度很大（P＜0.001）。这说明雌性Hartley豚鼠可以作为自发性OA的动物模型,而0.5月龄至6月龄的雄性豚鼠并没有自发形成OA。这与人类的情况相似,女性较男性膝关节OA的发病率高,发病的年龄低。性别可能通过包括激素在内的多重通道影响软骨的新陈代谢,从而促进了膝关节的OA形成。2月龄的雌性Hartley豚鼠处于OA的临界状态,适宜作为干预试验的OA动物模型。血清中PG含量的下降与OA的发生相关,并且发生早于软骨组织的结构改变,比组织学检查的方法敏感,可以作为判断OA的早期指标。采用在抗炎试验和镇痛试验中的试验剂量,通过连续5个月的自由饮水,本研究观察了GS,CS和两者联合使用对2月龄的雌性Hartley豚鼠自发OA进程的影响。试验于给药前和给药后的每个月,采用上述四种染色方法分别对豚鼠膝关节的软骨组织进行了结构和组织成分的检查,以及测定了豚鼠血清中PG的含量。试验结果显示:在5个月的干预期中,GS组豚鼠软骨病理平均积分从给药前的4分上升至给药5个月后的（11.6±2.88分）,血清PG的含量从（122.64±29.6ng/ml）下降至（57.74±15.0 ng/ml）;CS组病理平均积分开始为4分,5个月后基本保持不变为（3.24±1.48分）,PG含量从（117.04±23.1 ng/ml）下降至（46.54±6.3ng/ml）;联合使用组病理平均积分开始也为4分,5个月后下降为（1.84±1.64分）,PG含量从（114.24±25.9 ng/ml）也下降至（50.44±12.7ng/ml）,而对照组病理平均积分从4分快速地上升至（14.8±1.10分）,PG含量则从（122.54±23.3ng/ml）急剧地下降到（30.94±5.8ng/ml）。各组给药前期相比,GS组在给药后4个月才发生了中等程度的OA病理改变;CS组只发生了轻微的OA病理改变;联合使用组一直维持着给药前期的临界状态,在给药5个月后,软骨组织恢复了正常;而对照组在给药后的3个月就发生了严重的OA改变。所有三个试验组血清中PG含量的下降缓慢,给药4个月后,与对照组相比,下降不明显,经统计学检验差异显著（P＜0.05）。GS和CS可以延缓和抑制雌性Hartley豚鼠关节软骨的病理改变以及血清PG含量的下降。GS和CS联合使用的软骨保护作用较单独使用的强,提示具有软骨修复和重建的作用。总之,衰老的软骨可能改变软骨细胞的功能,改变ECM中胶原和PG的属性以及对细胞因子,生长因子和机械因素的应答。GS和CS可以提高软骨基质的合成,减缓OA发展的进程,可能的作用机制为作用和影响许多OA调控剂的表达及其活性。这些调控作用包括抑制PG降解,抑制PG降解酶（aggrecanases）和炎症因子（MMPs,NO和PGE2）的合成和活性。GS和CS即能缓解OA的症状,又能改善OA的软骨结构。虽然软骨保护剂起效可能比NSAIDs的作用缓慢,但由于前者作用持续的时间较长,使用并无不良反应,软骨保护剂在OA的预防和治疗中仍会被广泛地运用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 GS和CS对小鼠抗炎作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 GS和CS对小鼠镇痛作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 Hartley豚鼠自发性OA发生的动态观察
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第四部分 GS和CS对原发性骨关节炎的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:博士期间发表的文章及完成的课题
• 致谢
• 综述