论文摘要
前列腺癌（Prostatic cancer,Pca）为西方国家最常见的恶性肿瘤,近十年我国Pca的检出率也明显上升,已位居泌尿系统肿瘤的第三位,其大多数都依赖于雄激素,但14—30个月后,几乎所有患者病变都将发展为激素非依赖性Pca,目前尚没有公认的有效的治疗非雄依赖Pca的手段和药物。自1996年哈医大首先报道静滴三氧化二砷（Arsenic trioxide,As2O3）治疗复发的急性早幼粒细胞白血病（APL）达到很高的完全缓解率以来,国内外学者对其抗肿瘤机制进行了广泛而深入的研究,已证实As2O3对多数肿瘤（包括实体瘤）有效,但对于非雄依赖的Pca及基因和端粒酶方面的研究甚少,故我们拟进一步探讨As2O3对前列腺癌非雄细胞系周期阻滞、凋亡及端粒酶活性的影响。同时,近年来的研究发现,Hedgehog（Hh）通路的激活在内胚层肿瘤包括的发生、发展中起重要作用,有学者称Hh信号通路可能是我们所了解的PCa发病的更可靠的机理,环杷明（Cyclopamine）是Hh通路的拮抗剂,本实验拟进一步印证Cyclopamine对前列腺癌非雄依赖细胞系PC-3细胞的影响及作用机制,为以后的联合用药及动物实验奠定基础。砷剂是一个剧毒化合物,Cyclopamine亦有导致动物畸形的报道,其用药的安全性是人们首要关注的问题之一,若通过前期试验进一步证实As2O3或Cyclopamine均可引起PCa非雄依赖的PC-3细胞的凋亡和周期抑制,并且分别或是均能抑制端粒酶及信号通路的活性,那么将As2O3同Cyclopamine联合应用,是否可以通过降低剂量而降低毒性和潜在副作用,同时又在前列腺癌非雄依赖细胞的研究中有着更好的抗肿瘤作用,从而成为更有效、更安全的非雄依赖的前列腺癌的中西医结合的治疗手段,需要实验进一步的探讨。本实验共分为四个部分:第一部分:三氧化二砷对前列腺癌PC-3细胞系细胞周期及端粒酶活性的影响我们应用体外细胞生长抑制试验（MTT比色法）研究对PC-3细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞周期分布情况及凋亡情况;TRAP-ELASA方法检测药物作用前后端粒酶的活性。MTT结果发现,6μmol/l As2O3对PC-3细胞即具有抑制作用,随着浓度的增加和作用时间的延长,抑制作用进一步增强,作用48小时,IC50为16.21μmol/L。18μmol/L的As2O3与PC-3细胞共培养48h后,电镜下部分癌细胞出现凋亡形态学改变,经6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol /L的As2O3作用48h后,细胞凋亡率逐渐增加,在流式图上可见到代表凋亡的亚G1峰,且24μmol/L组、18μmol/L组、12μmol/L组的As2O3组细胞凋亡率明显高于6μmol/组（P<0.05）。四组浓度处理后的PC-3细胞凋亡率分别为4.8%,15.2%, 19.6% ,29.7%,同正常组比较有显著性差异（P<0.01）,G0/G1期细胞比例明显增加,而S期和G2/M期细胞明显减少。PC-3细胞端粒酶活性随着作用时间及作用浓度的增加而降低,具有时间剂量效应关系,但当浓度增加至18μmol/L以上时,随着浓度的增加,对端粒酶活性的抑制无显著性差异（P>0.05）。第二部分:三氧化二砷对前列腺癌DU-145细胞周期阻滞及凋亡的影响DU-145也是非雄依赖的前列腺癌细胞系,研究结果发现,As2O3对DU-145细胞生长具有抑制作用,2μmol/L的As2O3作用24h即对DU-145细胞具有抑制作用,当浓度增加至6μmol/L以上时,抑制作用更为明显,作用48小时,IC50为8.02μmol /L,作用72小时IC50为6.21μmol /L;电镜观察DU-145细胞超微结构发现:8.0μmol/L的As2O3与DU-145细胞共培养48h后,部分癌细胞出现凋亡形态学改变,晚期可产生凋亡小体。流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的分布发现经6、8、10μmol/L的As2O3作用48h后, DU-145细胞凋亡率明显增加,与空白对照组比较有显著性差异（P<0.01）, G0/G1期细胞比例明显下降,而G2/M期细胞比例明显增加,和对照组相比有显著性差异（P<0.01）,在48小时2μmol/LAs2O3作用组未见代表细胞凋亡的亚G1峰,而在8μmol/L作用组,在正常二倍体峰前面可看到一个明显的代表凋亡的亚G1峰;As2O3处理DU-145细胞基因组DNA电泳结果发现:不同浓度的As2O3处理DU-145细胞48h后,基因组DNA凝胶电泳呈现明显的梯状图谱,这是核小体间DNA成180-200bp整倍断裂的结果。第三部分:Cyclopamine对非雄依赖的前列腺癌PC-3细胞的影响通过MTT检测Cyclopamine对细胞生长增殖的影响,BrdU掺入检测PC-3细胞DNA合成的情况,流式检测Cyclopamine对PC-3细胞周期的影响, TRAP-ELISA法细胞检测端粒酶的活性。实验结果显示:Cyclopamine可以通过抑制Hh信号转导通路而明显抑制PC-3细胞的增殖,在4-8μmol/L有明显的抑制作用; BrdU掺入结果PC-3细胞未加Cyclopamine时BrdU掺入阳性细胞平均约占细胞总数的79%±5.6,加入2μmol/L的Cyclopamine作用48小时后PC-3细胞BrdU掺入阳性细胞平均约占细胞总数的49%±8.3,低于对照组79 %±5.6 （P<0.05 ）,加入4μmol/L的Cyclopamine作用48小时后PC-3细胞BrdU掺入阳性细胞平均约占细胞总数的30%±6.8,明显低于对照组（P<0.01）,但加入Tomatidine（Cyclopamine类似物）作用48小时后BrdU掺入阳性细胞平均约占细胞总数的72%±6.9,与对照组相比差异无显著性（P>0.05）;流式细胞仪检测细胞周期的结果为:4μmol/L的Cyclopamine作用48 h后,PC-3细胞进入S期比例由空白对照组的34.8%±1.13下降为13.7%±0.18,G1期的细胞比例由空白对照组的46.8%±1.32下降为34.8%±0.78, G2期的细胞比例由空白对照组的19.7%±0.49上升为52.4%±0.56, Cyclopamine处理组在流式图上还出现了明显的凋亡峰;Cyclopamine对PC-3细胞端粒酶活性在低浓度和高浓度时均无明显抑制作用,并且随着作用时间的延长,亦无抑制作用。第四部分:低剂量砷剂联合Cyclopamine对前列腺癌细胞株PC-3生长影响的研究通过MTT检测不同浓度砷剂联合Cyclopamine对PC-3细胞生长的影响,电镜观察低剂量砷剂（6μmol/L）和Cyclopamine（2μmol/L）对PC-3细胞形态和超微结构的影响,以流式细胞仪检测细胞凋亡,TRAP-ELISA检测端粒酶活性,BrdU掺入方法检测低剂量砷剂和Cyclopamine对PC-3细胞DNA合成的影响, RT-PCR法检测GLI1的表达。实验结果显示:低剂量砷剂联合Cyclopamine可以明显抑制PC-3细胞的增殖,作用48h可见细胞凋亡;流式细胞图发现经6μmol/L的As2O3和2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后,在流式图上可见到代表凋亡的亚G1峰,联合用药组的细胞凋亡率明显高于6μmol/L的As2O3组和2μmol/L的Cyclopamine组（P<0.01）,其凋亡率与高浓度As2O3组（18μmol/L）的凋亡率无显著性差别（P>0.05）,高于4μmol/L的Cyclopamine组（P<0.05）;PC-3细胞对照组BrdU掺入阳性细胞平均约占细胞总数的79%±2.33,低剂量砷剂和Cyclopamine联合用药组作用PC-3细胞48h后,BrdU掺入阳性细胞数平均约占细胞总数的26%±3.82,与单药作用组分别作用有显著性差异（P<0.01）,与4μmol/L的Cyclopamine作用组及18μmol/L的As2O3作用组相比则无显著性差异（P>0.05）;6μmol/L的As2O3作用PC-3细胞48h后可以抑制端粒酶的活性,吸光度A值为0.792±0.011,而联合用药组作用PC-3细胞48h后亦可抑制端粒酶的活性,吸光度A值为0.769±0.045,两组之间无显著性差异（P>0.05）;但与对照组相比（A值为0.892±0.021）均有显著性差异（P<0.05）;RT-PCR结果显示,在DNALadder约292bp处出现明暗相间的分子条带,即为目的基因GLI1;而在约579 bp处出现粗细、明暗均较均一的条带,此即内参GAPDH,说明PC-3细胞GLI1的表达较强,与2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后,GLI1的表达有所减弱,随着其浓度的增加,在4μmol/L组GLI1的表达进一步减弱,与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）;而联合用药组尽管对GLI1的表达也有抑制,与对照组相比有显著性差异（P<0.05）,但与2μmol/L的Cyclopamine单独用药组相比,抑制作用无增强或减弱,统计学分析无显著性差异（P>0.05）,进一步的研究发现,无论是低剂量砷剂还是高剂量砷剂,其对GLI1的表达均无影响。结论:一.As2O3可明显抑制前列腺癌非雄依赖的PC-3细胞的增殖,其途径可能与以下两方面机制有关,一是诱导细胞凋亡,抑制细胞周期,二是下调细胞的端粒酶活性,但对Hh信号通路的关键因子GLI1的活性无影响。二.As2O3对前列腺癌非雄依赖的DU-145细胞系也有明显的抑制作用,且随着药物浓度增加和作用时间延长,凋亡细胞明显增加,出现G2/M期阻滞和DNA的断裂。三.Cyclopamine可以通过抑制Hh信号转导通路而明显抑制PC-3细胞的增殖和DNA的合成,降低GLI1的表达,抑制细胞的周期,诱导细胞的凋亡,但对细胞端粒酶活性无抑制作用。四.低剂量砷剂（6μmol/L）和Cyclopamine（2μmol/L）的联合应用可以抑制PC-3细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,细胞凋亡率明显高于6μmol/L的As2O3组和2μmol/L的Cyclopamine组,与高浓度As2O3组（ 18μmol/L ）的凋亡率无显著性差别,但明显高于4μmol/L的Cyclopamine组;其对端粒酶的活性和GLI1的表达均有抑制作用,但与单药作用组相比无显著性差异,二者的联合应用,有协同作用,可以通过降低药物剂量,降低潜在的可能的毒副作用,并取得同样甚至优于高剂量单药作用同样的抑制PC-3细胞的效果。