一、CIK细胞体内外抗肝癌细胞的实验研究（论文文献综述）
苏棋[1]（2019）在《积雪草酸对人肝癌SMMC-7721细胞体内外增殖和凋亡的影响》文中提出目的:研究积雪草酸（AA）对人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖及凋亡的影响;利用小动物活体成像技术观察AA对人肝癌裸鼠移植肿瘤生长的影响,从而研究AA体内抗肝癌效应及其凋亡的机制方法:不同浓度的AA作用于人肝癌SMMC-7721细胞24 h后显微镜观察其细胞形态变化,CCK-8法检测各组细胞活力值,AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率变化,JC-1试剂盒检测肝癌细胞线粒体膜电位改变,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡相关蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肝癌细胞中的表达。荧光素酶逆转录病毒转染人肝癌SMMC-7721细胞,嘌呤霉素梯度筛选得到稳定感染的克隆肝癌细胞（简称SMMC-7721-Luc）。选用45周龄雄性BALB/c裸鼠15只,建立人肝癌SMMC-7721-Luc细胞裸鼠皮下移植瘤模型后,随机分为模型组、AA 50mg/Kg组和AA 100mg/Kg组,每组5只。各组裸鼠连续灌胃给药21 d,分别于给药第7 d,14 d,21 d进行活体成像观察,并在末次活体成像观察后处死裸鼠后取瘤块称重并测量其体积大小,HE病理染色观察瘤块内细胞形态以及数量的变化;TUNEL染色法检测瘤块细胞凋亡情况;免疫组织化学法测定瘤块P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3的阳性表达的平均积分光密度值（IOD）;Western Blot法测定凋亡相关蛋白P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3和Cleaved Caspase-3在肿瘤组织中的表达。结果:CCK-8结果显示:与溶剂对照组相比,随着AA浓度的增加,抑制率增大,细胞数量变少,形态变圆,呈浓度依赖性（P<0.01）,IC50=38.31μM;AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式结果显示:与溶剂对照组相比,随着浓度的增加,AA显着提高对人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡率（P<0.01）;此外,JC-1结果显示:与溶剂对照组比较,AA浓度依赖性降低线粒体膜电位（P<0.01）,在荧光显微镜下可以看到红色/绿色荧光的比值随浓度的增大而明显降低;Western blot结果显示:40μM AA明显上调Bax,Cyt-C和Cleaved Caspase-3蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）,下调Bcl-2,Caspase-3的表达（P<0.01）,但不影响P53的表达（P>0.05）。在体内实验中,成功构建了人肝癌SMMC-7721-Luc裸鼠皮下移植瘤模型。活体成像动态观察显示,与模型组相比较,50mg/Kg组和100mg/Kg组的AA能明显抑制肿瘤的增长（P<0.01）;瘤块称重和体积测量结果显示:与模型组比较,100mg/Kg的AA能明显减少瘤块的质量和体积（P<0.01）。HE病理染色结果显示,与模型组相比,AA 50mg/Kg和AA 100mg/Kg剂量组均能不同程度地促进肝肿瘤组织细胞凋亡:细胞呈现凋亡形态,细胞数减少;TUNEL染色结果显示:与模型组比较,50mg/Kg AA组和100mg/Kg AA组均能使肝肿瘤细胞凋亡率逐渐增高（P<0.01）;免疫组织化学方法结果显示:与模型组比较,Bax,Cyt-C,Caspase-3在AA 50mg/Kg剂量组和AA 100mg/Kg剂量组中平均积分光密度值阳性表达区域均明显升高,Bcl-2阳性表达区域降低,差异均有统计学意义（P<0.01）,P53表达无明显变化,无差异统计学意义（P>0.05）;Western Blot结果显示,与模型组相比,Bax,Cyt-C,Cleaved Caspase-3蛋白表达在50mg/Kg和100mg/Kg AA组中均明显升高,Bcl-2和Caspase-3蛋白表达降低（P<0.05或P<0.01）,P53蛋白表达无明显变化,统计学无差异（P>0.05）。结论:AA可抑制人肝癌SMMC-7721细胞体外增殖及裸鼠移植瘤体内生长,其机制可能与AA诱导非P53依赖的线粒体途径的凋亡有关。
于明安[2]（2011）在《微波消融联合过继免疫预防肝癌术后复发的实验及临床研究》文中指出研究背景：肝癌在我国肿瘤相关死亡率中仅次于肺癌,位居第二。对于局灶性肝癌无论手术还是微波、射频等热消融技术都可以达到灭活肿瘤的目的。但肝癌术后具有易复发性（5年复发率为50-70%）,患者在根治术后远期生存率仍然较低。放疗、化疗等传统治疗对预防肝癌的术后复发没有确切疗效,而免疫治疗以其安全有效、特异性强和无毒副作用等优点,已成为当今基础和临床研究的热点。本研究是在总结前阶段研究的基础上,对免疫治疗程序设计、频次和治疗后评估指标进行改进,并观察患者治疗后免疫指标的变化和临床疗效。目的：1研究小鼠H22肝癌细胞悬液在现有临床应用的温控条件下（54℃、60℃）微波消融后细胞存活、凋亡和死亡的比例,并观察肿瘤相关抗原表达情况；2研究小鼠原位肝癌经微波消融后不同区域肿瘤相关抗原的表达情况；3研究微波消融联合免疫治疗对患者各项免疫指标和肝功指标的影响；4研究微波消融联合免疫治疗对肝癌患者术后复发、肝外转移及生存的影响。方法：体外实验：本实验按不同消融温控条件设为3组：对照组,消融温度54℃组和60℃组。消融后两小时流式检测悬液中细胞不同状态百分比,包括存活、凋亡和死亡；免疫荧光检测肿瘤相关抗原表达情况,包括CD147和热休克蛋白70（HSP70）。体内实验：开腹瘤块种植法制作昆明鼠原位肝癌模型8只。肿瘤长至直径约5mm时麻醉开腹,将微波针在直视下插入肿瘤中央,测温针放置在肿瘤边缘,瘤周温控60℃。消融后24小时脱颈处死小鼠,免疫荧光检测肿瘤不同区域（肿瘤中心区、肿瘤边缘区）肿瘤相关抗原（CD147、HSP70）表达情况。临床研究：1微波消融联合免疫治疗对患者术后免疫和肝功影响的研究：实验组为自愿接受微波消融联合过继免疫治疗的14例肝癌患者,对照组为同期仅行微波消融并自愿进行定期免疫和肝功指标检测的15例患者。两组患者在性别,年龄,肿瘤最大直径及分化程度等一般资料方面没有统计学差异,对两组患者术前及治疗后免疫指标和肝功指标进行比较；同时按自身配对原则对实验组14例患者术前和术后3个月外周血PBMC增殖情况进行比较。2微波消融联合免疫治疗肝细胞肝癌对患者肝内复发,肝外转移和患者生存影响的研究。实验组为自愿接受微波消融联合免疫治疗的14例患者,对照组为单纯进行微波消融治疗的42例患者。两组患者在性别,年龄,肿瘤最大直径及分化程度等一般资料方面没有统计学差异。免疫治疗组患者于微波消融后第9天、第1、3个月各做一个疗程免疫治疗,之后每隔3个月根据患者淋巴细胞绝对计数、T淋巴细胞亚群检测结果综合判断是否需要继续进行免疫治疗。比较两组间肝内复发率,肝外转移率和生存率。结果：体外研究：流式检测结果,消融后2小时54℃和60℃组细胞存活率低于对照组（P<0.05）,凋亡和死亡率高于对照组（P<0.05）。60℃组细胞凋亡率高于54℃组（86.0% vs 61.0%）（P<0.05）,存活和死亡率均低于54℃组（P<0.05）。免疫荧光检测结果：两个温控组中均可检测到肿瘤相关抗原（CD147、HSP70）,其中60℃组两种抗原表达率均高于54℃组（HSP70：98.33% vs 46.22%,CD147：44.0% vs19.44%）（P<0.05）,同一温控组HSP70表达率高于CD147（P<0.05）。体内实验：小鼠原位肝癌微波消融后24小时免疫荧光所见,在肿瘤边缘温控条件为60℃,有CD147和HSP70表达,主要在细胞膜表达,但胞浆和细胞间质部位均可见染色。在肿瘤中心区域温度达85℃时,该区域只有HSP70表达,且在细胞和周围间质区均可见荧光染色,CD147未见表达。临床研究：1微波消融联合免疫治疗对患者免疫和肝功指标影响的研究：实验组和对照组术前淋巴细胞计数、T淋巴细胞各亚群百分比没有统计学差异（P>0.05）,治疗后6个月实验组淋巴细胞计数高于对照组（P<0.05）；实验组细胞毒性淋巴细胞亚群（CD3+/CD8+,CD8+/CD28+,NKT）高于对照组,抑制性T淋巴细胞亚群（CD8+/CD28-,T-reg）低于对照组（P<0.05）,表明免疫治疗对患者免疫状态具有正向调节作用；实验组与对照组术前白蛋白和胆碱酯酶比较没有统计学差异（P>0.05）,术后6个月实验组高于对照组（P<0.05）；实验组术前和术后3个月抽取45ml外周血分离PBMC计数没有统计学差异（P>0.05）,术后3个月PBMC培养终点DC和CIK培养目标亚群比例（CD83+,CD86+,CD3+/CD8+）高于术前,且差异有统计学意义（P<0.05）。2微波消融联合免疫治疗肝细胞肝癌对患者肝内复发,肝外转移和患者生存影响的研究：实验组随访期内（4-26个月,中位随访时间19个月）患者有4例（28.6%）肝内复发,其中包括3例（21.4%）局部肿瘤进展和1例（7.1%）远处复发；对照组随访期内（4-26个月,中位随访时间16个月）有11例（26.2%）肝内复发和1例（2.3%）肝外转移,肝内复发包括2（4.8%）例局部肿瘤进展和9例（21.4%）远处复发。两组间在肝内复发率、局部肿瘤进展率、远处复发率、肝外转移瘤和无瘤生存时间比较无统计学差异（P>0.05）。随访期内对照组有4例患者死亡,实验组没有患者死亡,两组间生存率比较无统计学差异（P>0.05）。结论：实验研究表明,临床现有温控条件下H22细胞悬液微波消融后,大部分肿瘤细胞死亡或凋亡,并表达肿瘤相关抗原。小鼠原位肝癌微波消融后,肿瘤边缘温度为60℃时可见两种肿瘤相关抗原表达。临床研究表明,微波消融术后联合免疫治疗可以改善患者肝功能,提高淋巴细胞计数,优化T淋巴细胞各亚群比例,并可以提高细胞毒性淋巴细胞的增殖活性。由于实验组例数较少,尚未发现微波联合免疫治疗在预防肝癌术后复发和延长患者生存期等方面的优势,该研究还需进一步扩大病例数,延长随访时间。
赵杨祉[3]（2011）在《肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞体外扩增影响因素及杀伤活性研究》文中提出目的：探究肿瘤患者自身因素对CIK、NK细胞体外扩增能力的影响并检测其对肿瘤细胞的杀伤活性,为CIK、NK细胞在恶性肿瘤治疗中的应用进一步提供理论依据。方法：第一部分：对既往于我科行CIK和NK自体细胞免疫治疗的恶性肿瘤患者进行回顾性分析,探讨患者年龄、性别、疾病种类、分期以及淋巴细胞亚群分布对CIK和NK细胞体外扩增能力的影响。在培养过程中每天计数细胞的数量,在培养前后分别应用倒置显微镜观察细胞的形态变化、应用流式细胞仪检测CD3+CD56+的CIK细胞以及CD3-CD56+NK细胞比例的变化情况。在培养的第14天收获细胞。第二部分：在培养的第7和第14天收获细胞,应用ELISA试剂盒检测CIK、NK细胞培养体系上清液中细胞因子IFN-γ的分泌水平。MTT法和Calcein-AM/PI荧光染色法检测CIK、NK细胞对K562细胞株的杀伤活性。结果：1.肿瘤患者CIK、NK细胞的扩增能力低于正常人,但与年龄、性别、疾病种类无关。而疾病分期、淋巴细胞亚群分布等是影响CIK、NK细胞体外扩增能力的因素；Ⅲ-Ⅳ期患者CIK、NK细胞的扩增比例低于Ⅰ-Ⅱ期患者。而诱导后NK细胞的比例与诱导前NK细胞的比例呈正相关,与诱导前CD8+细胞的比例呈负相关。2.经过14 d的体外培养后CIK细胞的比例由2.03±0.17%升至30.78±15.29%,NK细胞的比例由11.32±3.42%升至58.32±10.13%,低于正常人外周血来源的CIK、NK细胞的扩增比例,细胞因子IFN-γ分泌水平分别升至10.0±0.44pg/mL、14.76±0.42pg/mL,均低于正常人CIK、NK细胞的分泌水平。3.诱导前肿瘤患者和正常人PBMC细胞的杀伤活性在各个效靶比时无差异,而诱导后CIK、NK细胞的杀伤活性较培养前PBMC细胞显着增强,随着效靶比的增加,CIK、NK细胞对K562细胞株的杀伤活性逐渐增强,尤以CIK联合NK细胞的杀伤活性最强,在效靶比为25：1时可高达80%。结论：肿瘤患者CIK、NK细胞的体外扩增比例低于正常人,而与自身年龄、性别、疾病种类无关,但与疾病分期、淋巴细胞亚群分布相关。而诱导前患者外周血中NK细胞及CD8+细胞的比例与NK细胞的体外扩增能具有一定的相关性；可以通过体外诱导扩增获得大量的CIK、NK细胞,细胞因子IFN-γ的分泌水平及K562细胞株的杀伤活性显着增强,而CIK联合NK细胞的杀伤活性最强,可作为一种新型的过继免疫效应细胞应用于临床治疗恶性肿瘤。
吴晓琳[4]（2010）在《CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗肿瘤作用及其机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:过继性细胞免疫治疗（Adoptive cellular immu-notherapy, ACI）是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞（特异性的和非特异性的）,以直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤目的的一种生物治疗方法。近年来,由于综合治疗的合理应用,相当一部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或缓解,但患者由于长期化疗导致全身情况较差,且出现干细胞受损,外周血管损伤,患者耐受性差,需寻求新的治疗手段。目前,细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells, CIK）过继免疫治疗已进入临床试验,国内外诸多报道显示其对多种恶性肿瘤均有一定的疗效,是一种很有潜力的免疫细胞治疗方法。CIK细胞是一种增殖速度快,杀瘤活性高,杀瘤谱广的高效免疫活性细胞,并且对正常造血影响轻微,对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病变及骨髓净化都具有良好效果。迄今为止,CIK细胞对淋巴瘤细胞株作用的基础研究及在淋巴瘤的临床应用的报道较多,但在淋巴瘤荷瘤鼠体内研究尚少。本试验通过检测应用CIK处理前后Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植瘤细胞的细胞周期及凋亡的变化,CIK处理前后荷瘤鼠瘤体大小的变化、荷瘤鼠瘤组织bcl-2、Ki-67蛋白表达的差异,研究观察CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的抑制作用,并探讨其作用机制,为CIK细胞进一步应用于临床提供理论依据。方法:1肿瘤细胞的传代培养:将Burkitt淋巴瘤Raji细胞加入含10%FBS的1640培养基悬浮,置于37℃、5%CO2,饱和湿度条件下传代培养,取对数生长期的细胞用于实验。2 CIK细胞的制备及体外扩增:取正常人的外周肝素抗凝血,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离外周血单个核细胞（Peripheral bloodMononuclear cell,PBMC）,依据不同时间分别加入γ-干扰素（IFN-γ）、抗CD3单克隆抗体（Anti-CD3Mcab）、白细胞介素-2（rhIL-2）等细胞因子,体外诱导成CIK细胞。以上培养细胞常规培养、传代。三天换液时取少量细胞悬液使用血细胞计数板计数并制作增殖曲线。3 MTT法测定CIK细胞对Raji细胞的杀伤作用:将CIK细胞与Raji细胞以不同效靶比（E:T分别为10:1、20:1、40:1）,加入96孔板,每组3复孔,常规设相应空白对照,培养24、48小时后,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定分光光度值（OD）,计算杀伤活性。4建立荷瘤裸鼠模型并分组:在Balb/c-nu/nu裸小鼠腋下接种Burkitt淋巴瘤Raji细胞1×107ml,0.2ml/只,建立淋巴瘤裸鼠模型。每3天定时用游标卡尺测量移植瘤大小,记录长径和短径,按公式（体积=长径×短径2/2）计算肿瘤体积大小并绘制肿瘤生长曲线。裸鼠成瘤后,将荷瘤鼠随机分为A、B、C 3组（每组各5只）:A为生理盐水对照组,B、C均为CIK细胞治疗组,分别在瘤旁注射体外培养14天的CIK细胞,注射量分别为2×107/0.2ml/只,4×107/0.2ml/只,每组均隔日一次,共三次。5杀鼠取瘤并进行相应项目的检测:第7天裸鼠颈椎脱臼处死,剥离肿瘤块并称重,用游标卡尺测量肿瘤的大小,并计算肿瘤的体积,计算肿瘤生长抑制率。机械法处理肿瘤制成单细胞悬液,流式细胞术测定细胞凋亡率,并测定bcl-2、Ki-67蛋白的表达水平。结果:1 CIK细胞对Raji细胞有明显杀伤作用,不同效靶比（10:1,20:1,40:1）的CIK细胞与Raji细胞共同作用不同时间（24h,48h）后,OD值均有不同程度减少,且随着CIK细胞浓度的增加、作用时间的延长,OD值逐渐减小,而CIK细胞对Raji细胞的杀伤作用随之增加,作用时间为24h时CIK细胞对Raji细胞杀伤活性分别为（15.7±1.4）%、（33.8±2.3）%、（49.2±2.1）%;作用时间为48h时杀伤活性分别为（27.9±1.7）%、（59.3±2.0）%、（78.3±1.6）%。相同作用时间不同效靶比之间差异有统计学意义（P<0.05）,同一效靶比不同作用时间之间差异也有统计学（P<0.05）。2与生理盐水对照组相比,CIK细胞治疗组荷瘤鼠瘤体均较前缩小,差异有统计学意义（P<0.05）,B组抑瘤率为（23.7±0.56）%,C组抑瘤率为（54.3±0.68）%,试验组（B、C）与对照组（A）相比差异均有统计学意义（P<0.05）,试验组（B、C）组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。3荷瘤鼠移植瘤细胞经不同密度的CIK细胞（0、2×107/0.2ml、4×107/0.2ml）作用后,G0/G1期细胞比例随CIK细胞数目的增加逐渐增加（所占百分比分别为28.56±1.69、34.41±0.34、53.43±1.87）,同时S期及G2/M期细胞比例逐渐减少, S期所占比例分别为（52.66±4.60）%、（49.62±1.22）%、（34.87±0.67）% , G2/M期所占比例分别为（17.87±0.49）%、（15.43±0.44）%、（11.97±1.23）%,由此得出移植瘤细胞的增殖指数（PI）也随之逐渐降低, A、B、C各组PI分别为（72.18±3.32）%、（64.40±1.31）%、（46.91±0.69）%,试验组（B、C）移植瘤细胞各期所占比例及PI分别与对照组（A）相比差异均有统计学意义（P<0.05）,试验组（B、C）组间比较差异亦有统计学意义（P<0.05）。4移植瘤细胞经不同密度的CIK细胞（0,2×107/0.2ml,4×107/0.2ml）作用后,FCM检测移植瘤细胞凋亡,结果显示对照组未见明显的凋亡峰,试验组（B、C）经流式细胞仪测得典型的亚二倍体凋亡峰,随CIK细胞密度的增加,凋亡峰值增加,细胞凋亡率增高,凋亡率分别为（6.19±1.16）%、（13.17±0.17）%,与对照组（0.94±0.87）%相比有统计学差异（P<0.05）。5经过不同密度CIK细胞作用后,由FCM测得移植瘤细胞bcl-2蛋白荧光指数（FI）分别为A:1.00±0.01、B:0.96±0.01、C:0.87±0.02。Ki-67蛋白荧光指数（FI）分别为A:1.00±0.01、B:0.95±0.01、C:0.83±0.02,由此可见移植瘤细胞bcl-2蛋白及Ki-67蛋白表达均较对照组下降,二者与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）;CIK细胞治疗组间比较亦有统计学差异（P<0.05）。结论:1 CIK细胞对Burkitt淋巴瘤Raji细胞有杀伤活性;且此杀伤活性与CIK细胞数量、共培养时间呈正相关,有明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系;2体内抗肿瘤实验结果证实正常人CIK细胞可有效抑制Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植模型瘤体的生长;3 CIK细胞能够影响淋巴瘤移植瘤细胞周期分布,引起G0/G1期阻滞,从而阻止瘤细胞进入分裂相,使增殖减慢,并且CIK细胞还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡;4 CIK细胞在体内对Raji细胞的抑制作用与抑制bcl-2、Ki-67蛋白表达水平有关。
莫晨,黄燕苹,罗社文,吴小娥,邓笑伟,徐铭宝[5]（2008）在《树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养后对人肝癌细胞株HEP-3杀伤活性的研究》文中提出目的研究树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后增殖活性、表型的变化和其对人肝癌细胞株HEP-3杀伤活性的影响。方法分离外周血单个核细胞（PBMC）,经不同细胞因子作用后定向分化成DC和CIK细胞,将收获的DC与CIK共培养3 d,以流式细胞仪检测CIK细胞膜表面分子表达,MTT法检测共培养后CIK细胞对HEP-3杀伤活性的变化。结果CIK与DC共培养3 d后增殖活性开始显着提高,与DC共培养的CIK较单独培养的CIK具有更强的杀瘤活性。结论共培养后DC能够促进CIK增殖,提高其对肝癌细胞的杀伤活性,为指导临床应用DC与CIK联合治疗原发性肝癌提供了实验依据。
李安娜[6]（2008）在《IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究》文中研究表明第一部分人IL-2基因克隆及重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体的构建目的:克隆人白细胞介素2基因（IL-2）,构建重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体。方法:从PHA体外刺激培养的Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,以反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法制备互补DNA（cDNA）模板,以PCR方法扩增IL-2基因,扩增产物纯化后克隆至测序载体pGEM-T-Easy,挑取阳性克隆经鉴定后测序,将测序正确的IL-2基因片段用BglⅡ和PmeⅠ双酶切消化回收并纯化后定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中。酶切鉴定后通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,并使用TCID50法测定AdBM5-GFP-IL-2重组腺病毒滴度。结果:采用RT-PCR法克隆出IL-2基因,经基因测序显示克隆的IL-2序列完全正确,全长528bp,含462个碱基开放读框。构建出pAdBM5-GFP-IL-2真核表达载体。经HEK293A细胞体外扩增,3天后即见绿色荧光蛋白的表达,11天可见噬斑的出现。纯化后的重组腺病毒AdBM5-GFP-IL-2滴度可达5×107PFU/ml。结论:成功构建了含IL-2基因的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP-IL-2）,为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础。第二部分人IL-2转染的CIK细胞联合DC对肝癌细胞的杀伤作用目的:探讨IL-2基因转染的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）联合树突状细胞（DC）对肝癌细胞的杀伤作用。方法:采用密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞（PMBC）,分别诱导CIK细胞（培养体系:将分离得到的PMBC置于培养箱培养2小时,收集悬浮细胞,采用抗CD3单克隆抗体50ng/ml、rhIL-21000U/ml、rhIL-1 1000U/ml和IFN-γ1000U/ml联合诱导培养CIK细胞）和DC（培养体系:贴壁细胞经rhIL-4 100ng/ml和rhGM-CSF 100ng/ml诱导培养DC）。用携带IL-2基因的重组腺病毒AdBM5-GFP-IL-2转染CIK细胞（MOI=100）,用HepG2肝癌冻融抗原冲击致敏DC（DC与肝癌抗原的比例为1:20）,然后将转染IL-2基因的CIK细胞（CIKpIL-2）与肝癌抗原致敏DC（DC-Ag）共培养,制备肝癌抗原致敏DC激活的IL-2基因修饰的CIK细胞（DC-Ag-CIKpIL-2）。采用MTT法检测CIK、DC-CIK、DC-Ag-CIK、DC-CIKpIL-2、DC-Ag-CIKpIL-2对肝癌HepG2细胞的杀伤作用,效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1,同时以肝癌细胞H7404、白血病细胞K562作为靶细胞进行杀伤对照实验。结果:DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2细胞组显示了很强的抗肝癌作用,在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时,DC-Ag-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为（37.28%±5.71、50.82%±4.95、62.72%±3.78）,DC-CIKpIL-2对HepG2的杀伤活性分别为（35.16%±2.22、42.67%±5.26、59.93%±6.71）,均高于CIK（19.14%±3.28、28.14%±2.43、44.23%±5.33）、DC-CIK（47.86%±3.27、32.36%±4.62、22.60%±1.83）、DC-Ag-CIK（51.41%±1.43、35.34%±2.57、22.83%±1.67）对HepG2肝癌细胞的杀伤活性（各组间比较均为P＜0.05）;DC-Ag-CIKpIL-2与DC-CIKpIL-2对K562、H7404细胞也显示出较强的杀伤活性。DC-Ag-CIKpIL-2细胞组与DC-CIKpIL-2细胞组的杀瘤活性比较,差异无统计学意义（在效靶比分别为10∶1、20∶1、40∶1时二组间比较P值分别为:0.58、0.12和0.56）。杀瘤作用随着效靶比的增高而增强。结论:经DC激活的IL-2基因转染的CIK细胞具有更强的抗肝癌作用,本实验为CIK细胞治疗肝癌及肝癌的过继免疫治疗提供实验依据,有一定的指导意义。
胡晓杰[7]（2008）在《CIK细胞联合奥沙利铂对人胃癌奥沙利铂耐药细胞体外抗肿瘤作用的实验研究》文中研究指明目的:胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,在我国其死亡率居恶性肿瘤之首。化疗作为肿瘤术后最有效的辅助治疗手段,在防治肿瘤的复发与转移方面有着举足轻重作用。奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药,已逐渐作为治疗进展期胃癌的主要药物,且显示出良好的应用前景。虽然目前胃癌的化疗方案不断完善,但部分胃癌患者对化疗的疗效并不理想,其中多药耐药（multidrug resistance, MDR）是导致化疗失败的根本所在。随着肿瘤免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,细胞因子疗法作为抗肿瘤的分子治疗学手段受到国内外学者的广泛关注,呈现出良好的前景。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine- induced killer,CIK）是一种新型、高效、广谱的免疫活性细胞,研究表明,CIK细胞具有较强的体内外抗胃癌细胞活性,有可能用于临床上进展期胃癌的过继免疫治疗。而且免疫效应细胞对MDR肿瘤细胞的杀伤活性较其对亲本细胞相似甚至更高。目前关于CIK细胞联合化疗对MDR肿瘤细胞体内外杀伤作用的研究较少。本研究在建立人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞OCUM-2MD3/L-OHP的基础上,应用病理形态学以及MTT等方法,观察CIK细胞联合L-OHP对胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞OCUM-2MD3/L-OHP的体外抗肿瘤作用,为临床应用CIK细胞联合化疗治疗耐药性胃癌提供实验依据。材料及方法:1材料1.1实验细胞:人胃癌高侵袭转移细胞株OCUM-2MD3,由日本大阪医科大学外一科八代正和教授惠赠。人胃癌高侵袭转移奥沙利铂耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP,由本科室培养建立,耐药指数（resistant index,RI）4.3,且传代或冻存3个月后复苏仍维持相似的耐药性。耐药蛋白P-gp其在耐药细胞系中的表达高于亲本细胞系。将两种细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃,5%CO2孵育培养,分别取对数生长期的两种细胞,配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液备用。1.2实验药物:奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）,江苏恒瑞制药厂生产,0.9%生理盐水稀释成1200μg/mL、600μg/mL、300μg/mL、150μg/mL、75μg/mL备用。1.3效应细胞（CIK细胞）的制备和体外扩增:取正常人的外周肝素抗凝血,经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离PBMC,PBS洗涤后细胞被重悬并保存于由RPMI-1640、10%人AB血清、25mmol/LHEPES、2mmol/L-谷氨酰胺、100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μmol/L 2-巯基乙醇组成的培养液中,PBMC调至1×106/mL后,第一天加入浓度为100μg/mL的rhIFN-γ,孵育24小时后,加入浓度为50μg/mL CD3McAb、100U/mL的rhIL-1和300U/mL rhIL-2,放置37℃,5%CO2孵箱中培养,细胞每2天更换新鲜培养液传代培养,同时补加rhIL-2 1000U/ mL,细胞第14天收获,用前调整效靶比为40:1,20:1和10:1。2分组（各组均以OCUM-2MD3细胞作为对照）2.1 L-OHP干预组:计算单独应用不同浓度的L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞24h、48h、72h的体外杀伤活性。2.2 CIK细胞干预组:OCUM-2MD3/L-OHP细胞作为效应细胞,CIK细胞作为靶细胞,计算单独应用不同效靶比CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞12h、24h、48h的体外杀伤活性。2.3 CIK细胞联合L-OHP干预组:按效靶比40:1加入CIK后12h后再加入不同浓度L-OHP,24h后计算两者的联合应用对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性。3方法3.1应用倒置相差显微镜观察以上三组中OCUM-2MD3/ L-OHP细胞的病理形态学变化。3.2应用MTT法检测以上三组在570nm波长处光密度（OD）值,分别计算不同时间L-OHP、CIK细胞单独以及两者联合应用对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性。4统计方法实验数据用SPSS 12.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显着性。结果:1体外杀伤活性的病理形态学观察倒置相差显微镜下OCUM-2MD3/L-OHP细胞系与OCUM-2MD3细胞系细胞相比,形态无明显区别。1.1 L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞体外杀伤活性的病理形态学观察倒置显微镜下观察,将OCUM-2MD3/L-OHP细胞加药培养24h后细胞数目稍有减少,排列疏松,细胞形态变圆,体积变小,折光性差,核浆比变大,出现飘浮的细胞,且胞浆内可见较多颗粒;培养48h后细胞数目继续减少,胞浆内颗粒增多,且可见细胞碎片;培养72h后细胞数目继续减少,可见较多细胞碎片。L-OHP对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用强于OCUM-2MD3/L-OHP细胞,各时段OCUM-2MD3细胞减少数目及细胞碎片的量远大于OCUM-2MD3/L-OHP细胞。对照组胃癌细胞仍贴壁生长,状况良好。1.2 CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞体外杀伤活性的病理形态学观察CIK细胞为悬浮生长细胞,呈圆形,细胞生长活跃时抱团率增加。在倒置显微镜下观察到CIK细胞具有一定的方向性运动能力,逐渐聚集到OCUM-2MD3/L-OHP细胞周围,OCUM-2MD3/L-OHP细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失,使贴壁生长的癌细胞出现漂浮。效靶细胞共育12h时OCUM-2MD3/L-OHP细胞数明显减少,24h细胞明显漂浮,并且在培养液中出现碎片。48h在培养液中出现大量碎片。CIK细胞对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用与OCUM-2MD3/L-OHP细胞相似。对照组胃癌细胞仍贴壁生长,状况良好。单独CIK细胞未见趋动现象,均匀铺满视野。1.3 CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性的病理形态学观察倒置显微镜下观察, CIK细胞逐渐聚集到OCUM-2MD3/L-OHP细胞周围,OCUM-2MD3/L-OHP细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失,使贴壁生长的癌细胞出现漂浮,效靶细胞共育12h时OCUM-2MD3/L-OHP细胞数明显减少,加入L-OHP后,胞浆内颗粒增多,可见大量细胞碎片,CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3细胞的杀伤作用与OCUM-2MD3/L-OHP细胞相似。2体外杀伤活性的MTT法检测结果2.1 L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性24h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为111.3μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为354.4μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了3.2倍。48h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为71.2μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为235.2μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了3.3倍。72h时,L-OHP对OCUM-2MD3细胞作用的IC50为522.3μg/mL,对OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50为1057.0μg/mL,OCUM-2MD3/L-OHP对L-OHP的耐受性较亲代敏感株OCUM-2MD3增加了2.0倍。L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3细胞的体外杀伤活性在48h最强。且随L-OHP浓度的增加而增强。2.2 CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性12h时,CIK细胞对耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于其亲代敏感株OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。24h时,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。48h时,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性明显高于OCUM-2MD3（P<0.05）。且杀伤活性随效靶比的增高而增强。CIK细胞对两种靶细胞的杀伤活性均在24h最高,且杀伤活性随效靶比的增高而增强,CIK细胞在各时间段对耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP的杀伤活性,均明显高于其亲代敏感株OCUM-2MD3（P<0.05）。提示与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞对OCUM-2MD3/L-OHP细胞有较强的体外杀伤活性。2.3 CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP的体外杀伤活性CIK细胞联合L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3的体外杀伤活性均较单纯使用L-OHP或CIK细胞的杀伤活性明显增加（P<0.05）。联合杀伤活性的大小随L-OHP浓度的升高而增加。联合CIK细胞治疗后,L-OHP对OCUM-2MD3和OCUM-2MD3/L-OHP细胞作用的IC50降低。与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞联合L-OHP对人胃癌高侵袭转移耐药细胞株OCUM-2MD3/L-OHP具有明显的协同作用（P<0.05）。结论:1与亲本细胞OCUM-2MD3相比,耐药细胞OCUM-2MD3/ L-OHP在形态学上无明显区别。L-OHP对之作用后,胞浆内颗粒增多,且可见细胞碎片;CIK细胞作用后,细胞胞浆内出现颗粒状物,细胞逐渐模糊、消失。两者联合作用后效果更明显。2与OCUM-2MD3细胞相比,L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞的体外杀伤活性较低。L-OHP对OCUM-2MD3/L-OHP细胞和OCUM-2MD3细胞的体外杀伤活性均随L-OHP浓度的增加而增强,且在给药后48h最高。3与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞对OCUM-2MD3/ L-OHP细胞的体外杀伤活性较高。CIK细胞的杀伤活性随效靶比的增高而增强。CIK细胞对两种靶细胞的杀伤活性均在24h最高。4与单用L-OHP或CIK细胞作用相比,CIK细胞联合不同浓度的L-OHP对两种肿瘤细胞的杀伤活性均明显升高。且与OCUM-2MD3细胞相比,CIK细胞联合L-OHP对OCUM- 2MD3/L-OHP具有更明显的协同杀伤作用。
吴杏尧,陈英梅,肖彩琼[8]（2008）在《细胞因子诱导的杀伤细胞2种回输方法治疗原发性肝癌的不良反应观察》文中提出原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,HCC）患者经手术、化疗及放疗后难以改变其生存质量,且预后极差。近年来生物治疗运用在临床中已显示其独特优势,细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞在体内外增生能力强,具有强大的抗肿瘤活性,可以满足过继性免疫治疗中抗肿瘤细胞的要求,已成为肝癌手术、放疗、化疗后的一种新的
杨葳[9]（2008）在《抗原负载的DC与CIK共培养后对MGC-803胃癌细胞株杀伤活性的研究》文中指出目的:胃癌是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一,目前胃癌临床治疗手段主要是根治性切除手术辅以术前、术后化疗及放射治疗。由于临床所见病例多为中晚期患者,手术及放、化疗效果差,长期生存率较低,因此,如何提高胃癌根治术后效果,改善胃癌晚期患者生活质量,预防胃癌复发及转移一直是临床长期探索的问题。肿瘤过继性细胞免疫治疗（adoptive cellular immunotherapy,ACI）是继手术、化疗和放疗之后的第四种肿瘤治疗模式。迄今,NK细胞、CTL、MΦ、TIL、LAK、CIK和DC细胞的过继治疗已在临床上得到应用,其中CIK和DC细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗以其独特的优势,近年来成为国内外众多学者的研究热点。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）是由多种细胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3单克隆抗体等诱导而成的对多种肿瘤具有杀伤活性的细胞毒性T细胞,其溶瘤活性具有非MHC限制性,是一种非特异性的免疫杀伤细胞。CIK细胞能分泌多种细胞因子（如IL-4、IFN-γ等）,且具有比LAK、CD3AK细胞更强的杀伤活性。树突状细胞（dendritic cells,DC）是功能强大的主要的抗原递呈细胞,分布于除脑和睾丸以外身体各部的任何组织,DC借助膜表面不同受体可有效捕获低浓度抗原,并能与这些抗原表面的MHC I类和II类分子结合,刺激初始型CD8+T细胞和CD4+T细胞活化。综合国内外研究表明,将负载肿瘤抗原的DC细胞和具有高效杀伤活性的CIK细胞联合应用治疗恶性肿瘤,将有望起到协同作用。本研究将利用MTT法和流式细胞仪分别完成负载抗原的DC和CIK的联合培养物对MGC-803的杀伤活性和凋亡机制的初步研究,为DC和CIK联合治疗胃癌应用于临床打下科研基础。材料与方法:1 PBMC来源的CIK和DC细胞制备:提取人外周血单个核细胞（PBMC） ,在体外以基因重组人白介素-2（interleukine-2,IL-2）、鼠抗人CD3单抗（anti-CD3McAb）、基因重组人白介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）、基因重组人干扰素-γ（interferon-γ,INF-γ）等细胞因子刺激非贴壁细胞获得成熟CIK;以基因重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage CSF,GM-CSF）和基因重组人白介素-4（interleukine-4,IL-4）刺激贴壁细胞获得DC,并以流式细胞仪检测细胞表型。2 MGC-803胃癌细胞可溶性抗原制备及定量:以液氮反复冻融MGC-803细胞,过滤,制成用以刺激DC细胞的可溶性抗原,以考马斯亮蓝法对蛋白抗原进行定量测定。3不同效靶比和培养天数下,不同效应细胞组杀伤功能的比较:将效应细胞分作3组:单纯CIK组、未负载MGC-803抗原的DC+CIK组和负载MGC-803抗原的DC+CIK组,分别记做:CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK。效应细胞培养12d后,以MTT法测定CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK对MGC-803杀伤作用,效靶比分别为:2.5:1、5:1、10:1、20:1,并测定不同时间对其作用的影响。4酶联免疫吸附法检测外分泌细胞因子水平:提取培养6d、12d和21d的Ag-DC-CIK细胞上清液,检测细胞外分泌细胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ含量随培养天数的变化。5 Ag-DC-CIK对MGC-803细胞增殖及凋亡的作用:将培养18d的效应细胞和靶细胞混合培养（E:T=20:1）24h后,收集细胞,加入Hoechst 33342至终浓度为1ug/ml,37℃孵育10min,离心,弃染液。加入PI染液重悬避光染色。流式细胞仪分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。结果:1单独培养的CIK细胞在第3d开始增殖,第5-6d进入快速增殖期,CIK细胞和DC（包括负载和未负载MGC-803抗原）共培养后的第12d开始,共培养细胞组的增殖速度开始明显增快,并快于同源CIK细胞（p<0. 05）。2健康成年PBMC在体外可以分别由IL-2、CD3McAb、IL-1α、INF-γ和GM-CSF、IL-4诱导出经表型鉴定为成熟的CIK和DC细胞。其中有（79.64±3.41）%的细胞表达成熟DC特异性表面标志CD83,（95.17±1.22）%的细胞表达HLA-DR,（94.66±2.42）%的细胞表达CD86,（86.59±1.09）%的细胞表达CD40。与DC共培养的CIK细胞在培养第14d时CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量进一步升高到59.39%-60.46%和35.67%-36.90%,经抗原刺激过的DC与CIK共培养14d后,混合细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞最多,达到63.63%-65.42%和51.03%-53.15%,与CIK组和DC-CIK组相比均具有显着性差异（p<0.05）。3在2.5:1-20:1效靶比范围内,DC-CIK对MGC-803靶细胞的杀伤活性一般均高于同源CIK细胞,经MGC-803细胞冻融物致敏的Ag-DC-CIK共培养细胞对MGC-803靶细胞的杀伤活性有进一步的提高,与单纯CIK细胞组比较差异显着（p<0.05）,与DC-CIK共培养细胞组比较也有显着性差异（p<0.05）。4 IFN-γ在21d的混合细胞上清液中表达较高,TNF-α在各个时期均能检测到,但表达水平变化很明显,在第6d时低表达,21d时较高。促炎因子IL-2变化正好与TNF-α相反,主要在第6d高表达,21d时表达相对较低或不表达。5 24h组凋亡早期、中期、晚期细胞及正常细胞在FCM散点图中占绝大多数比例,而48h组以坏死细胞为主,凋亡细胞已较24h明显减少。结论:1负载MGC-803胃癌细胞抗原的DC可使CIK的增殖速度进一步提高。2负载MGC-803抗原的DC与CIK共培养后可使具备攻击能力的主要细胞群CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞群比例分别进一步提高。3经抗原冲击的DC与CIK共培养后能增强其对胃癌细胞MGC-803的杀伤活性。4 Ag-DC-CIK在体外培养过程中不仅需要持续来源于外界细胞因子的存在,而且该效应细胞组还能够向细胞外分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2影响其自身的功能。5在效靶相互作用初期,Ag-DC-CIK对MGC-803的杀伤作用主要通过诱导肿瘤细胞凋亡,同时发生自身凋亡来实现;在相互作用的中晚期,细胞开始趋向坏死。
郝明志,陈强,叶韵斌,肖景榕,林海澜,吴晖,余文昌,张孔志,陈起忠,刘友晓,郑伟生[10]（2006）在《肝动脉栓塞化疗联合CIK细胞疗法治疗原发性肝癌》文中指出目的:评价肝动脉栓塞化疗联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法治疗原发性肝癌的临床疗效。方法:以生存期为观察终点指标,采用同期非随机对照方法,对2003年1月至2005年12月接受肝动脉栓塞化疗联合异体CIK细胞疗法的21例原发性肝癌患者（治疗组）与单纯肝动脉栓塞化疗46例患者（对照组）比较,观察两组的生存期差异。结果:治疗组与对照组中位生存期分别为22个月（95%CI,737）、10个月（95%CI,812）。两组的半年、1年、2年生存率分别为85·71%、58·35%、48.62%和69.05%、32.74%、3.97%,治疗组生存期明显长于对照组（P<0.05）。结论:肝动脉栓塞化疗联合CIK细胞疗法较单纯肝动脉栓塞化疗有可能提高原发性肝癌患者的远期生存率。
二、CIK细胞体内外抗肝癌细胞的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、CIK细胞体内外抗肝癌细胞的实验研究（论文提纲范文）
（1）积雪草酸对人肝癌SMMC-7721细胞体内外增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中英文缩略语表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 积雪草酸对人肝癌SMMC-7721 细胞体外增殖凋亡的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CCK-8 法测定AA对人肝癌SMMC-7721 细胞增殖的影响 |
| 3.2 AnnexinV-APC/7-AAD双染色法流式细胞术检测AA对人肝癌SMMC-7721 细胞的凋亡影响 |
| 3.3 JC-1 试剂盒检测AA对人肝癌SMMC-7721 细胞膜电位变化的影响 |
| 3.4 Western blot法检测人肝癌SMMC-7721 细胞中的P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3,Cleaved Caspase-3 的蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 积雪草酸对人肝癌SMMC-7721 细胞体内增殖凋亡的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 活体成像动态观察AA对 SMMC-7721-Luc皮下移植瘤的生长 |
| 3.2 积雪草酸对SMMC-7721-Luc皮下移植瘤生长的影响 |
| 3.3 肿瘤组织的HE染色及病理学观察 |
| 3.4 TUNEL染色法检测瘤块细胞凋亡 |
| 3.5 免疫组织化学法检测P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C和 Caspase-3 的表达 |
| 3.6 Western Blot法测肿瘤组织P53,Bax,Bcl-2,Cyt-C,Caspase-3 和Cleaved Caspase-3 在瘤块当中的表达 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（2）微波消融联合过继免疫预防肝癌术后复发的实验及临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 微波消融在不同温控条件下诱导H22细胞凋亡及 相关肿瘤抗原表达的体外实验研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料和方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第二部分 肝癌微波消融术后肿瘤不同区域抗原表达 的动物实验研究 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 第三部分 微波消融联合过继免疫预防肝癌术后复发的 临床研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞体外扩增影响因素及杀伤活性研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 CIK细胞的生物学特性 |
| 1.2 CIK细胞的抗肿瘤作用 |
| 1.2.1 CIK细胞的作用机制 |
| 1.2.2 CIK细胞体内外抗肿瘤活性 |
| 1.2.3 CIK细胞的临床应用 |
| 1.3 NK细胞生物学特性 |
| 1.3.1 NK细胞分化发育 |
| 1.3.2 NK细胞功能特征 |
| 1.4 NK细胞作用机制 |
| 1.4.1 NK细胞主要通过下机制杀伤靶细胞 |
| 1.4.2 NK细胞表面受体 |
| 1.4.3 NK细胞的抗肿瘤作用 |
| 1.5 CIK、NK细胞在异基因骨髓移植中的作用 |
| 1.6 CIK、NK细胞的免疫调节作用 |
| 1.7 未来发展方向 |
| 1.7.1 应用双特异性抗体 |
| 1.7.2 基因修饰的人工受体 |
| 1.7.3 单克隆抗体 |
| 1.7.4 携带溶瘤病毒 |
| 1.7.5 外源性DEX疫苗 |
| 1.8 展望 |
| 第2章 肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞体外扩增影响因素研究 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞的制备 |
| 2.3.2 CIK、NK细胞体外增殖情况及形态观察 |
| 2.3.3 培养后CIK、NK细胞免疫表型检测 |
| 2.3.4 分组情况 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 第3章 肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞杀伤活性研究 |
| 3.1 原理 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 统计学分析 |
| 3.5 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞体外扩增影响因素 |
| 4.2 CIK、NK细胞体外诱导扩增情况 |
| 4.3 CIK、NK细胞IFN-Γ的分泌水平 |
| 4.4 CIK、NK细胞体外细胞杀伤活性检测 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗肿瘤作用及其机制的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗肿瘤作用及其机制的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞因子诱导的杀伤细胞在非霍奇金淋巴瘤中 的应用研究 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养后对人肝癌细胞株HEP-3杀伤活性的研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 肿瘤细胞株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CIK细胞培养 |
| 1.2.2 DC细胞培养 |
| 1.2.3 DC与CIK共培养 |
| 1.2.4 流式细胞仪分析共培养后CIK细胞表型变化 |
| 1.2.5 MTT法体外细胞毒测定 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 2 结 果 |
| 2.1 CIK与DC共培养后增殖活性的影响 |
| 2.2 共培养对CIK细胞表型影响 |
| 2.3 共培养后CIK细胞对HEP-3的细胞毒作用 |
| 3 讨 论 |
（6）IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究（论文提纲范文）
| 常用缩略语中英文对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:人IL-2基因克隆及重组pAdBM5-GFP-IL-2腺病毒载体的构建 |
| 1 实验材料及实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二部分:人IL-2转染的CIK细胞联合DC对肝癌细胞的杀伤作用 |
| 1 实验材料及实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 在校期间发表的相关论文 |
| 致谢 |
（7）CIK细胞联合奥沙利铂对人胃癌奥沙利铂耐药细胞体外抗肿瘤作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 CIK 细胞联合奥沙利铂对人胃癌奥沙利铂耐药细胞体外抗肿瘤作用的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CIK 细胞联合化疗药物在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）抗原负载的DC与CIK共培养后对MGC-803胃癌细胞株杀伤活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 抗原负载的DC 与CIK 共培养后对MGC-803胃癌细胞株杀伤活性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CIK 细胞治疗恶性肿瘤研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）肝动脉栓塞化疗联合CIK细胞疗法治疗原发性肝癌（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 治疗方法 |
| 1.3 疗效评价 |
| 2 结果与方法 |
| 2.1 治疗组与对照组的临床资料分析 |
| 2.2 生存分析 |
| 2.3 生存期的评价 |
四、CIK细胞体内外抗肝癌细胞的实验研究（论文参考文献）
- [1]积雪草酸对人肝癌SMMC-7721细胞体内外增殖和凋亡的影响[D]. 苏棋. 广西医科大学, 2019(08)
- [2]微波消融联合过继免疫预防肝癌术后复发的实验及临床研究[D]. 于明安. 中国人民解放军军医进修学院, 2011(10)
- [3]肿瘤患者自体外周血来源CIK、NK细胞体外扩增影响因素及杀伤活性研究[D]. 赵杨祉. 吉林大学, 2011(10)
- [4]CIK细胞对淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗肿瘤作用及其机制的实验研究[D]. 吴晓琳. 河北医科大学, 2010(04)
- [5]树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养后对人肝癌细胞株HEP-3杀伤活性的研究[J]. 莫晨,黄燕苹,罗社文,吴小娥,邓笑伟,徐铭宝. 武警医学, 2008(09)
- [6]IL-2基因转染的CIK细胞联合树突状细胞的抗肝癌实验研究[D]. 李安娜. 广西医科大学, 2008(10)
- [7]CIK细胞联合奥沙利铂对人胃癌奥沙利铂耐药细胞体外抗肿瘤作用的实验研究[D]. 胡晓杰. 河北医科大学, 2008(01)
- [8]细胞因子诱导的杀伤细胞2种回输方法治疗原发性肝癌的不良反应观察[J]. 吴杏尧,陈英梅,肖彩琼. 中国实用护理杂志, 2008(07)
- [9]抗原负载的DC与CIK共培养后对MGC-803胃癌细胞株杀伤活性的研究[D]. 杨葳. 河北医科大学, 2008(01)
- [10]肝动脉栓塞化疗联合CIK细胞疗法治疗原发性肝癌[J]. 郝明志,陈强,叶韵斌,肖景榕,林海澜,吴晖,余文昌,张孔志,陈起忠,刘友晓,郑伟生. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2006(04)