宁夏贺兰山东麓葡萄酿酒酵母菌的分离及其分类鉴定

论文摘要

酵母菌是葡萄酒生产中的主要微生物有机体,对于葡萄酒酿造质量具有十分重要的作用。目前我国葡萄酒酿造使用的酵母菌完全依赖进口,导致葡萄酒质量同质化问题日趋严重。我国西北地区生态条件复杂多样,蕴含着丰富的酵母菌资源,进口葡萄酒活性干酵母的广泛使用,会降低酵母的多样性和本土酵母作用的重要性,正使我国酵母菌资源受到日益严重的威胁,急需对酿酒酵母菌本土资源进行抢救性研究和保护。宁夏贺兰山东麓具有典型的气候特征和独特的地理条件,是中国葡萄栽培的最适生态区之一,也是近年来新兴的葡萄酒产区。本研究旨在收集调查宁夏葡萄产区的酿酒酵母资源,阐明该地区酵母菌种类、多样性和生态规律,建立葡萄酒酵母种质资源库,发掘具有中国产区特色的酵母菌种质,为我国酿酒酵母菌的多样性研究、利用和优良菌种的选育,为最终解决国产葡萄酒风味的同质化、提高国际竞争力奠定基础。本研究中,在宁夏贺兰山东麓共采集葡萄酿酒酵母菌株552株,通过细胞和菌落形态观察、WL营养培养基（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar）聚类分析,将采集于银广夏三基地葡萄园的125株酵母菌株分为7个培养类型,将采集于西夏王陵葡萄园的264株酵母菌株分为5个培养类型,将采集于玉泉营农场葡萄园的163株酵母菌株分为6个培养类型。结合26S rDNA D1/D2和5.8S-ITS区序列分析,对所分离的酵母菌进行分子分类鉴定,结果表明:分离获得的宁夏贺兰山东麓葡萄酿酒酵母菌分属于葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspera uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、罕见有孢汉生酵母（Hanseniaspora occidentalis）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、Candida zemplinina以及大隐球酵母（Cryptococcus magnus）等8属10个种。其中银广夏三基地的葡萄酒相关酵母菌分属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、罕见有孢汉生酵母（Hanseniaspora occidentalis）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspera uvarum）等7个种;西夏王陵葡萄园的葡萄酒相关酵母菌分属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Candida zemplinina、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspera uvarum）等4个种;玉泉营农场葡萄园的葡萄酒相关酵母菌分属于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉生酵母（Hanseniaspera uvarum）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）、Candidazemplinina等5个种。银广夏三基地葡萄园采集的材料中,占主导地位的葡萄酒相关酵母菌是H. uvarum、H. occidentalis、S. cerevisiae,分别占16.8%、16.8%和56.8%;在西夏王陵葡萄园采集的材料中,数量最多的酵母菌种是I. orientalis、H. uvarum、S. cerevisiae,分别占总数的17.63%、58.99%和20.14%;玉泉营农场采集的材料中,其优势菌种为C. zemplinina、H. uvarum、S. cerevisiae,分别占21.19%、31.8%和45.03%。其中H. uvarum、S. cerevisia是适应性较为广泛的种。三个不同地区葡萄自然发酵过程中酵母群体总体变化趋势是一致的。葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）在发酵前期占主导地位,为启动发酵的最主要菌种。到自然发酵中期,一些非酿酒酵母菌群逐渐减少和死亡,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在发酵液中开始生长。到发酵后期,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）成为主要发酵动力群体主导发酵结束。不同自然发酵过程中非酿酒酵母的种类、组成及发展变化存在一定的差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄酒相关酵母菌的概况
• 1.1.1 葡萄酒相关酵母菌的来源
• 1.1.2 葡萄酒相关酵母菌的定义与种类
• 1.1.3 葡萄酒相关酵母菌的分类
• 1.1.4 葡萄酒相关酵母菌的生物多样性
• 1.2 非酿酒酵母的概况
• 1.2.1 非酿酒酵母的定义
• 1.2.2 非酿酒酵母在葡萄酒酿造中的作用
• 1.2.3 非酿酒酵母的研究进展和现状
• 1.3 酵母菌分类鉴定及相关研究进展
• 1.3.1 常规分类学方法
• 1.3.2 化学分类学方法
• 1.3.3 分子分类学方法
• 1.4 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 葡萄酒相关酵母菌的分离
• 2.1.3 菌种的保藏
• 2.2 菌株的WL 聚类分析
• 2.3 代表性菌株的形态学鉴定
• 2.4 菌株的分子生物学鉴定
• 2.4.1 模板DNA 的制备
• 2.4.2 26S RDNA D1/D2 区和5.8S-ITS 区扩增
• 2.4.3 PCR 反应产物的电泳检测
• 2.4.4 序列测定、比较分析及系统发育树的构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 菌株的WL 营养培养基聚类
• 3.1.1 银广夏三基地葡萄自然发酵中酵母菌的WL 聚类
• 3.1.2 西夏王陵葡萄园葡萄自然发酵中酵母菌的WL 聚类
• 3.1.3 玉泉营农场葡萄自然发酵中酵母菌的WL 聚类
• 3.2 代表性菌株的形态特征
• 3.2.1 代表性菌株的繁殖与形态特征
• 3.2.2 代表性菌株WL 的形态特征和显微形态特征
• 3.3 菌株的RDNA 序列分析
• 3.3.1 银广夏三基地葡萄自然发酵中酵母菌的序列分析
• 3.3.2 西夏王陵葡萄园葡萄自然发酵中酵母菌的序列分析
• 3.3.3 玉泉营农场葡萄自然发酵中酵母菌的序列分析
• 3.3.4 亲缘关系分析
• 3.3.5 5.8S-ITS 区序列分析
• 3.4 自然发酵中酵母菌群特点
• 第四章 讨论
• 4.1 关于WL 培养基在葡萄酒相关酵母菌分类鉴定中的应用
• 4.2 26S RDNA D1/D2 区序列分析对葡萄酒相关酵母菌的鉴定
• 4.3 5.8S-ITS 区序列分析对葡萄酒相关酵母菌的鉴定
• 4.4 不同地理环境下葡萄酒相关酵母菌群组成及种类的差异
• 4.5 不同生态条件下非酿酒酵母菌群组成及菌种的差异
• 4.6 自然发酵过程中酵母菌群动态变化
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介