猪干扰素a和γ在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达及重组蛋白初步应用

论文摘要

一、为获得猪干扰素α（Porcine interferon alpha,PoINF-α）和干扰素γ（Porcine interferon gamma,PoINF-γ）基因,本研究参照Genebank已发表的猪干扰素α和干扰素γ基因序列,分别设计一对引物,应用反转录多聚酶链式反应,从有丝分裂原刀豆素（ConA）诱导的猪脾淋巴细胞总RNA中扩增出猪干扰素α和干扰素γ基因,将扩增片段通过T-A策略连接到克隆质粒pGEM-T载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定,证明克隆片段为猪干扰素α和干扰素γ基因。与网上公布的猪干扰素α和干扰素γ基因序列进行比较,其序列同源性分别99.8%和100%。从而为进一步应用该基因在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中进行表达奠定了基础。二、杆状病毒/昆虫细胞是被广泛用来表达外源基因的表达系统,但许多表达的外源蛋白存在于细胞内,不能分泌到细胞上清。Tessier研究发现蜂素信号肽能够介导外源基因进行分泌表达,但又有该信号肽无效的报道,因此本课题的目的是研究蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中表达是否产生影响。根据蜂素信号肽序列,设计二条部分重叠的引物,通过PCR扩增出蜂素信号肽基因,然后与编码成熟猪干扰素α的基因片段通过PCR进行连接获得嵌合体基因片段,同时扩增出即不包含蜂素信号肽又不包含原有信号肽的仅编码成熟猪干扰素α的基因片段,将二个片段分别插入pFastBacTMDual载体,置于pH启动子控制下,酶切和测序验证正确后,转化到DH10Bac宿主菌,在三个抗性和IPTG、X-gal的共同作用下,通过定点转位获得穿梭载体bacmid。重组bacmid经电泳和PCR鉴定,然后转染昆虫细胞,获得重组杆状病毒。间接免疫荧光和Western blot鉴定重组蛋白的表达,结果表明,带有蜂素信号肽的猪干扰素α在昆虫细胞中实现分泌表达,而不带蜂素信号肽的猪干扰素α重组蛋白主要分布在昆虫细胞内。从而证明蜂素信号肽能够介导猪干扰素α在昆虫细胞中的分泌表达。通过猪水泡性口炎病毒（VSV）在猪肾细胞（PK-15）致病变抑制作用检测其抗病毒活性,表明带有蜂素信号的重组杆状病毒感染昆虫细胞获得的重组蛋白对VSV表现出较高的抑制活性,上清的抗病毒效价达到1.07×106 U/mL。昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为3.15×105 U/mL。上清中抗病毒活性为细胞中的抗病毒活性近3.4倍。不带蜂素信号肽的重组杆状病毒感染昆虫细胞获得的重组蛋白,细胞中的抗病毒活性为3.82×105 U/mL,上清中的抗病毒活性为9.67×104 U/mL。细胞中的抗病毒活性高于上清中的抗病毒活性。对比带蜂素信号肽和不带蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中的表达,蜂素信号肽能够介导猪干扰素α在昆虫细胞中达到分泌型表达,并且对表达具有增强作用,增强能力达到近3倍。三、为获得重组猪γ干扰素,本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素γ基因插入供体质粒pFastBacTMDual多克隆位点,置于pH启动子控制下,为实现分泌型表达,昆虫细胞可识别的蜂素信号肽取代猪α干扰素原有信号肽构建嵌合体基因,并在C端融合6个组氨酸标签以便于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞,在三个抗性作用下,通过蓝白斑筛选,获得重组Bacmid穿梭质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。猪γ干扰素重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞（PK-15）上抑制水泡性口炎病毒（VSV）致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到6.67×105 U/mL。重组猪γ干扰素的获得为进一步作为免疫佐剂对各种疫苗的增强作用,以及用作治疗剂在临床上治疗病毒性疫病等方面的研究奠定了基础。四、猪干扰素包含有α、β和γ三种,其中α、β属于Ⅰ型,具有较强的抗病毒作用,是由受病毒感染的多种体细胞产生,γ属于Ⅱ型干扰素,除具有较强的抗病毒作用外,还具有较强的免疫调节作用,主要是由被激活的T细胞和NK细胞产生。Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素联合使用,具有协同作用,比单独使用其中一种具有更强的抗病毒效果。为获得Ⅰ型和Ⅱ型复合型干扰素重组蛋白,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PoINF-α和PoINF-γ基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,分别置于pH和p10启动子控制下,为达到分泌型表达,二个基因的原有信号肽通过PCR技术替换为昆虫细胞可以识别并剪切的蜂素信号肽。获得重组转移载体后,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有二个外源基因的重组穿梭载体rBacmid,经脂质体介导转染昆虫细胞Sf9,获得包含二个外源基因的重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western-Blotting分析可见大小约为19kDa-21kDa的特异性条带及其它不同糖基化异构体。间接免疫荧光发现荧光信号主要分布在细胞膜上,证明是分泌型表达。抗病毒活性检测发现重组蛋白具有极强的抑制VSV病毒在PK-15细胞上增殖活性,上清抗病毒达到3.24×107 U/mL,细胞中抗病毒活性为5.86×106 U/mL。五、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的主要导致怀孕母猪后期流产、早产、死胎和木乃伊胎产弱仔增多,仔猪出现咳嗽、呼吸困难、呼吸急促等呼吸道症状和断奶前死亡率增高的一类疾病,在世界范围内广泛存在,给养猪业创成巨大的经济损失。许多报道证明干扰素对猪蓝耳病病毒具有抑制作用。本研究制备的复合型干扰素在Marc-145细胞上对猪蓝耳病病毒是否具有抑制作用。通过致病变抑制作用进行检测,结果表明复合型干扰素具有较强的抗病毒作用,干扰素粗制品经210稀释后,在Marc-145细胞上能够抑制猪蓝耳病病毒100TCID50的致细胞病变作用。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 综述一 干扰素的研究进展
• 1. 干扰素的分类和诱生
• 2. 干扰素的分子结构
• 3. 干扰素的生物学活性
• 4. 干扰素的受体和信号传导
• 5. 干扰素诱导产生的蛋白
• 6. 病毒对干扰素的逃避机制
• 7. 猪干扰素的生产和临床应用概况
• 8. 展望
• 综述二 杆状病毒/昆虫细胞表达系统综述
• 1. 杆状病毒的分类和生物学特点
• 2. 杆状病毒载体表达系统的特点
• 3. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的研究进展
• 4. 影响在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中表达外源蛋白的因素
• 5. 杆状病毒/昆虫细胞表达系统的应用
• 6. 结束语
• 前言
• 第一章 猪干扰素α和γ基因的克隆
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 第二章 蜂素信号肽对猪干扰素α在昆虫细胞中表达的影响
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 第三章 猪干扰素γ在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 第四章 猪干扰素α和γ在昆虫细胞中共表达及其抗病毒活性检测
• 1. 材料与方法
• 2. 结果和分析
• 3. 结论和讨论
• 第五章 重组复合型猪干扰素对猪蓝耳病毒的抑制作用
• 1. 材料与方法
• 2. 结果与分析
• 3. 结论与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录一 实验中主要仪器和试剂及其配制
• 附录二 英文符号缩写说明