首页> 正文

鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析

2020-11-22阅读(434)

鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析

论文摘要

鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（Duck plague, DP）,是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）引起的鸭、鹅及多种雁形目动物的一种急性、热性、败血性传染病。DEV系疱疹病毒科成员之一,其分子生物学方面的研究十分有限,相对落后于其它疱疹病毒,其基因组结构和物理图谱尚属未知。目前已知DEV TK、UL24和gH基因ORF,对于UL6、UL7和UL30基因仅已知部分核苷酸序列,其基因组90%以上属于未知,与此相关的基础研究,如病毒的基因功能以及病毒在机体细胞和组织中的复制机理、病毒感染过程以及机体抗病毒感染机制等多方面研究均有许多不明之处。同时,与此相关的预防、控制等措施以及基于基因组序列的基因工程疫苗的研究应受到重视。本实验研究主要以蚀斑纯化株DEV Clone-03的基因组未知序列为主要对象,以分子生物学技术为主要手段,提供病毒基因分子特性,为后续研究奠定基础。首先进行DEV的蚀斑纯化、增殖以及PCR检测;然后使用靶基因步行PCR（targeted gene walking PCR）方法扩增DEV基因组未知序列;之后进行病毒基因的ORF预测和序列分析;最后进行UL6基因的原核表达及融合蛋白兔体高免血清的制备。用CEF单层细胞对DEV疫苗株进行蚀斑纯化,将蚀斑纯化毒命名为DEV克隆疫苗（DEV Clone-03）株,将此毒通过绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚。根据GenBank发表的DEV LA（Lake Andes）株UL6基因部分核苷酸序列（登录号:AF043730）设计引物P1和P2;根据GenBank发表的DEV疫苗（DP-VAC）株UL30区域核苷酸序列（登录号:AF064639）设计引物P11和P12,用这两对引物对DEV Clone-03进行PCR检测。用P1和P2引物检测DEV Clone-03在鸡胚体内的分布,结果表明:接毒死亡鸡胚的尿囊膜、心、肝、脾、肺、肾和肌肉皮肤内均存在病毒;PCR敏感试验表明此方法可以检测到100μl尿囊液中提取的10-3稀释的病毒DNA。收取接毒死亡鸡胚尿囊液,磷钨酸负染电镜观察,可以见到典型的疱疹病毒粒子。Targeted gene walking PCR方法是以一段已知序列为出发点,采用特异性引物与非特异性引物相结合的方法扩增已知序列周围的未知序列部分,从而使已知序列不断延伸。本实验以DEV Clone-03基因组DNA为模板,用此方法扩增DEV Clone-03基因组未知序列,结果表明targeted gene walking PCR方法扩增DNA病毒基因组未知序列切实可行。选取两段核苷酸序列作为扩增起始点,其中一段是UL6区域的由引物P1和P2扩增的516 bp核苷酸序列（A）,另一段是UL30区域的由引物P11和P12扩增的234 bp核苷酸序列（B）。以A为起点扩增得到9 732 bp片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus 1,HSV-1）的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7蛋白具有同源性,将这7个基因分别命名为DEV Clone-03的UL1、UL2、UL3、UL4、UL5、UL6和UL7 HSV-1同源基因,各基因ORF大小依次为711 bp、474 bp、720 bp、714 bp、2 568 bp、2 373 bp和966 bp,编码氨基酸数量依次为236、157、239、237、855、790和321。以B为起点扩增得到17 841 bp的片段,从中预测到7个基因ORF,它们编码的多肽分别与HSV-1的UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29和UL30蛋白具有同源性,将这7个基因分

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1. 引言
  • 1.1 疱疹病毒分类
  • 1.2 疱疹病毒形态结构
  • 1.3 疱疹病毒基因组结构
  • 1.4 疱疹病毒基因及其编码产物
  • 1.5 鸭病毒性肠炎的国内外研究进展
  • 1.5.1 鸭病毒性肠炎简介
  • 1.5.2 鸭肠炎病毒简介
  • 1.5.3 鸭肠炎病毒形态发生
  • 1.5.4 鸭病毒性肠炎的诊断
  • 1.5.5 鸭病毒性肠炎的防制
  • 1.5.6 鸭肠炎病毒的分子生物学研究进展
  • 1.6 鸭病毒性肠炎存在的问题与展望
  • 1.7 研究目的和意义
  • 1.8 研究内容和方法
  • 2. 材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 病毒、鸡胚和鸡胚成纤维细胞
  • 2.1.2 载体与受体菌
  • 2.1.3 酶类及主要生化试剂
  • 2.1.4 引物
  • 2.1.5 主要仪器设备
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 鸭肠炎病毒的纯化
  • 2.2.2 病毒的鉴定
  • 2.2.3 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布
  • 2.2.4 PCR 敏感性测定
  • 2.2.5 Targeted gene walking PCR 扩增DEV Clone-03 未知基因
  • 2.2.6 PCR 产物的克隆和序列测定
  • 2.2.7 病毒基因的ORF 预测和序列分析
  • 2.2.8 分段进行DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 DEV 的纯化、增殖与鉴定
  • 3.1.1 DEV 引起的细胞和鸡胚病变
  • 3.1.2 PCR 鉴定产物及电镜观察
  • 3.1.3 引物P1/P2 PCR 扩增产物的核苷酸序列
  • 3.1.4 引物P11/P12 PCR 扩增产物的核苷酸序列
  • 3.1.5 PCR 检测病毒在鸡胚体内的分布
  • 3.1.6 PCR 检测的敏感性
  • 3.2 DEV Clone-03 基因的扩增
  • 3.2.1 DEV Clone-03 UL1～UL7 基因区和UL25～UL30 基因区
  • 3.2.2 UL1 基因序列分析
  • 3.2.3 UL2 基因序列分析
  • 3.2.4 UL3 基因序列分析
  • 3.2.5 UL4 基因序列分析
  • 3.2.6 UL5 基因序列分析
  • 3.2.7 UL6 基因序列分析
  • 3.2.8 UL7 基因序列分析
  • 3.2.9 UL25 基因序列分析
  • 3.2.10 UL26 基因序列分析
  • 3.2.11 UL26.5 基因序列分析
  • 3.2.12 UL27 基因序列分析
  • 3.2.13 UL28 基因序列分析
  • 3.2.14 UL29 基因序列分析
  • 3.2.15 UL30 基因序列分析
  • 3.3 DEV Clone-03 UL6 基因的分段表达
  • 3.3.1 表达载体pET-UL6-1 的构建
  • 3.3.2 表达载体pET-UL6-2 的构建
  • 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE 分析
  • 3.3.4 Western-blot 鉴定免疫后血清效价
  • 4. 讨论
  • 4.1 DEV 的蚀斑纯化、增殖和检测
  • 4.2 DEV UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的扩增和序列分析
  • 4.2.1 Targeted gene walking PCR 方法扩增DEV 基因
  • 4.2.2 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的排列
  • 4.2.3 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的起始密码子
  • 4.2.4 DEV Clone-03 UL1～UL7 和UL25～UL30 基因的特征
  • 4.3 DEV Clone-03 UL6 基因的原核表达
  • 4.4 实验创新
  • 5. 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

    • [1].Evaluation of early growth performance of 41 clones of teak(Tectona grandis Linn. f.) at four microsites in Purwakarta,Indonesia[J]. Journal of Forestry Research 2020(03)
    • [2].Machine-Learning Aided Analysis of Clone Evolution[J]. Chinese Journal of Electronics 2017(06)
    • [3].Characterization of a full-length infectious clone of bovine foamy virus 3026[J]. Virologica Sinica 2014(02)
    • [4].An Empirical Study of Code Clone Clustering Based on Clone Evolution[J]. Journal of Harbin Institute of Technology 2017(02)
    • [5].A BAC clone of MDV strain GX0101 with REV-LTR integration retained its pathogenicity[J]. Chinese Science Bulletin 2009(15)
    • [6].Qualitative analysis of catechins from green tea GMB-4 clone using HPLC and LC-MS/MS[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2015(12)
    • [7].Development and characterization of a clinical strain of Coxsackievirus A16 and an eGFP infectious clone[J]. Virologica Sinica 2015(04)
    • [8].Construction of an infectious cDNA clone of Tembusu virus isolated from breeder Peking ducks[J]. Virologica Sinica 2016(03)
    • [9].“克隆”能使人长生不老吗[J]. 小读者 2008(01)
    • [10].Screening of Adoptive Elite Tea (Camellia sinensis) Clones[J]. Journal of Northeast Agricultural University(English Edition) 2015(04)
    • [11].Comparison of protein patterns between Plasmodium falciparum mutant clone T9/94-M1-1(b3) induced by pyrimethamine and the original parent clone T9/94[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2012(01)
    • [12].Bacterial diversity, composition and temporal-spatial variation in the sediment of Jiaozhou Bay, China[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology 2011(03)
    • [13].Expression of DLK1 Gene in the Bone Marrow Cells of Patients with Myelodysplastic Syndromes and Its Clinical Significance[J]. Cancer Biology & Medicine 2012(03)
    • [14].Morphogenetic responses of Populus alba L. under salt stress[J]. Journal of Forestry Research 2014(01)
    • [15].Comparison of Bacterioplankton Communities in Three Heavily Polluted Streams in China[J]. Biomedical and Environmental Sciences 2011(02)
    • [16].Infectivity Analysis of Cloned Genomic DNA of P1 Agent in vitro[J]. 畜牧兽医学报 2009(S1)
    • [17].Deterministic assisted clone of an unknown four-particle entangled cluster-type state[J]. Chinese Physics B 2013(11)
    • [18].Molecular Characteristics of Neisseria meningitidis Isolated during an Outbreak in a Jail: Association with the Spread and Distribution of ST-4821 Complex Serogroup C Clone in China[J]. Biomedical and Environmental Sciences 2013(05)
    • [19].Options for converting a clone trial of Eucalyptus camaldulensis into a clonal seed orchard considering gain,fertility and effective clone number[J]. Journal of Forestry Research 2016(01)
    • [20].Construction of Full-length Infectious Clone for Encephalomyocarditis Virus BJC3 and Identification of the Rescued Virus[J]. 畜牧兽医学报 2010(S1)
    • [21].Ebp1的表达对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响[J]. 天津医科大学学报 2015(01)
    • [22].Age trends and correlations of growth and wood properties in clone of Eucalyptus urophylla × E. grandis in Guangdong, China[J]. Journal of Forestry Research 2012(03)
    • [23].An infectious clone of the highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Topology of glycoprotein 3 (GP3) addressing the intrachain disulfide bonds[J]. Chinese Science Bulletin 2011(26)
    • [24].Blocking CD38-driven fratricide among T cells enables effective antitumor activity by CD38-specific chimeric antigen receptor T cells[J]. Journal of Genetics and Genomics 2019(08)
    • [25].Establishment of the Clone of Anemarrhena asphodeloides Rhizomes[J]. Medicinal Plant 2012(09)
    • [26].Infectious Disease[J]. China Medical Abstracts(Internal Medicine) 2015(01)
    • [27].miRNA-451表达载体的构建及其在胃癌细胞系SGC-7901中的表达(英文)[J]. The Chinese-German Journal of Clinical Oncology 2013(08)
    • [28].Phylogenetic diversity of planktonic bacteria in the Chukchi Borderland region in summer[J]. Acta Oceanologica Sinica 2013(06)
    • [29].Transgenic plum Prunus domestica L., clone C5(cv. Honey Sweet) for protection against sharka disease[J]. Journal of Integrative Agriculture 2017(03)
    • [30].Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine 2016(06)

    标签：;  ;  ;  ;  

    鸭肠炎病毒部分基因组序列的克隆与分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5