冉进军蒲启康耿沐熹（华西公共卫生学院四川成都610041）
【摘要】华蟾素的药品名为华蟾素注射液(Cinobutaciniinjection，CINO)是我国临床中应用较广的抗肿瘤中药制剂，尤其对原发性肝癌、肺癌、食管癌等具有较好的疗效。近年来，中药华蟾素注射液治疗肝癌、肺癌、胰腺癌的I期临床研究已获得阶段成果，初步的实验结果显示，其抗肿瘤活性有效组分可能为其非极性部分。本文综述了华蟾素抑制肿瘤细胞的机制以及当今其用于各种癌症的研究的进展。
【关键词】华蟾素抗肿瘤机制研究进展
【中图分类号】R73-36【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）36-0109-03
CINO’smechanismofantineoplasticandresearchprogress
【Abstract】Cinobufagindrugcalledcinobufaciniinjection(Cinobutaciniinjection,)isanantineoplasticwhichiswidelyusedinclinicalinChina,especiallyforprimarylivercancer,lungcancer,esophagealcancer,hasagoodcurativeeffect.Recently,Chinesetraditionalmedicineofcinobufaciniinjectionforthetreatmentoflivercancer,lungcancer,pancreaticcancerofphaseIclinicalstudieshasobtainedstageachievement.Thepreliminaryexperimentsshowsthattheanti-tumor’sactivecomponentsmaybeprobablythenon-polarcomponent.In2005,thisprojectwasfinancedbytheAmericanNCIU19,tocarryonthetreatmentofpancreaticcancerinaphaseIIclinicalstudy.Thisarticlereviewsthecinobufagininhibitingtumorcellmechanismsandnowbeingusedforavarietyofcancerresearchprogress.
华蟾素（/01234567010）系传统中药中华大蟾蜍皮的水制剂，其重要成分为吲哚生物碱、还原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等，具有清热解毒，利水消肿，化瘀溃坚等作用，已列为国家级中药保护品种。蟾蜍作为药物治疗疾病由来已久，其药性理论记载，首见于我国第一部药物学专著《神农本草经》：“蝦蟆，味辛、寒，主邪气，破癥坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病”。“蟾蜍”之名，首见于《名医别录》，陶弘景注云，蝦蟆“一名蟾蜍”。蟾皮单独入药，始见于《本经逢原》：“蟾皮，辛、凉，微毒”。当代本草学巨著《中华本草》记载道：蟾蜍“味辛、性凉，有毒。归心、肝、脾、肺经”，能“解毒散结，消积利水，杀虫消疳。主治痈疽，疔疮，发背，瘰疬，恶疮，癥瘕癖积，臌胀，水肿，小儿疳积，破伤风，慢性咳喘”，并进一步指出“蟾蜍还被应用于肿瘤治疗，对胃癌、食管癌、膀胱癌、肝癌、白血病有一定疗效”现代药理研究发现其主要的两种生物活性成分是：(1)吲哚类生物碱(蟾毒色胺、蟾毒色胺内盐，去羟基蟾毒色胺等；(2)甾类强心苷(蟾蜍灵、华蟾蜍素、蟾蜍他灵等)，目前主要测定华蟾素中总生物碱的含量来控制质量。[1]现将华蟾素抗肿瘤方面的机理，以及用于肝癌、肺癌、食管癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、胆管癌、卵巢癌、消化道恶性肿瘤、人胶质瘤细胞的研究进行综述：
1.抗肿瘤机制
1.1抑制肿瘤细胞DNA和RNA的生物合成
DNA是构成染色质的主要物质，是决定细胞生长、分化、分裂和各种性状的重要因素。正常细胞核的DNA含量相对稳定，而恶性肿瘤细胞却具有DNA含量的异常，所以肿瘤细胞的DNA含量可以直接反映肿瘤的增殖能力。华蟾素抑制肿瘤细胞核酸代谢，干扰DNA和RNA的合成，阻碍细胞有丝分裂，直接参与杀伤癌细胞的作用。刘莉[2]等应用自动化图像分析技术对裸鼠人肝癌细胞经局部注射华蟾素治疗的肝癌细胞核DNA含量进行定量分析，结果经局部治疗的肝癌细胞核DNA含量下降，明显低于对照组，抑瘤生长率为57.9％。另有学者研究发现华蟾素对体外培养的H22腹水型小鼠肝癌细胞无直接杀伤作用，但能明显抑制其DNA和RNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的增殖。[3]
1.2诱导肿瘤细胞凋亡
肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡异常有关。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，细胞凋亡异常在恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。华蟾素能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，Jing[4]等认为华蟾素对细胞周期的影响类似于拓扑异构酶抑制剂的作用，并进一步研究发现，华蟾素处理细胞后，拓扑异构酶II的活性受到抑制，拓扑异构酶I的活性不受影响，说明华蟾素通过细胞内的信使传导系统最终使拓扑异构酶II减少，从而诱导细胞凋亡。
1.3诱导肿瘤细胞分化
肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，人类生存环境中即有致癌物质、促癌物质，也有能促进癌细胞向正常细胞转化的物质。Yamada[5]等发现蟾毒灵在功能上和形态上均能诱导白血病细胞的分化，并与全反式维甲酸有协调作用。另外的研究表明，CIN在在低浓度和时间相对较短时(24h内)对人喉癌Hep-2细胞具有诱导分化作用，当作用时间超过72h，则表现为抑制肿瘤细胞生长作用。
1.4抑制肿瘤血管形成
肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的基础，抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的新策。华蟾素能破坏或抑制血管生成，从而抑制肿瘤的生长和转移。Lee[6]等用原代培养的牛主动脉内皮细胞在溶胶原蛋白三维培养基中生成的毛细血管样网络结构为模型，观察蟾蜍灵对血管生成的影响，经图像分析仪定量检测，小剂量蟾蜍灵即可显著抑制毛细血管生成，FCM分析可见血管内皮细胞阻滞与G2／M期，细胞增殖受到抑制。
1.5逆转多药耐药
多药耐药性(multidrugresistant，MDR)指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性后，同时对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，是肿瘤化疗急需解决的难题。在现有条件下，解决方法有：将对化疗药物的多药耐药基凶转染至肿瘤患者的造血干细胞，使其具有比肿瘤细胞更强的化疗药物耐受力，从而提高临床化疗剂量和时间，同时减轻化疗最主要的不良反应——对骨髓细胞的损害；或寻找能逆转MDR以增加现有化疗物敏感性的药物。[7]
1.6影响癌基因的表达
在肿瘤形成和演化的多步骤过程中，癌基因、抑癌基因与细胞凋亡过程有相当重要的联系，细胞凋亡受到多种基因的调控，许多人体基因如p53，c-myc，bcl-2，bax，fas，fasL等都参与了凋亡的调控。其中p53，bcl-2和c-myc被认为具有重要的调节作用。p53为抑癌基因，参与DNA损伤引起的细胞周期阻滞和凋亡过程，野生型p53在多种情况下是阻碍细胞从G1期进入S期，因而可作为直接的凋亡基因而导致细胞凋亡。突变型p53失去对细胞增殖的负调控作用，可导致细胞增殖失控发生肿瘤。c-myc是一种控制细胞增殖和分化的原癌基因，它具有诱导细胞增殖和凋亡的双重作用，选择何种作用受其它调控因素的影响[8]。bcl-2是编码一个相对分子量为25000蛋白质的重要原癌基因，对细胞凋亡具有明显的抑制作用，在许多肿瘤的发生过程中，Bcl-2蛋白表达率呈逐渐增加的趋势，提示Bcl-2蛋白表达增加是肿瘤细胞凋亡受抑制的重要机制之一。
1.7增强机体的免疫功能
免疫功能的降低削弱了宿主对肿瘤细胞的生长监视、杀伤和清除能力，使病灶易于生长和转移，华蟾素对机体的免疫调节作用是华蟾素抗肿瘤的主要作用机理之一。华蟾素具有提高机体免疫力作用。林培英[9]等报道华蟾素能显著增加环磷酰胺（CTX）所致免疫抑制状态下的小鼠及SRBC致小鼠血清IgG含量，显著增加CTX所致白细胞减少症的小鼠外周血白细胞数，且能提高小鼠腹腔巨噬细胞指数，表明其对细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫均有促进作用。另有研究证实，华蟾素注射液不仅可诱导PBMC产生IL-2，还可增加LAK细胞的杀伤活性[10]。IL-2主要是由T辅助细胞产生的细胞因子，具有很强的免疫增强作用，对巨噬细胞、NK细胞、T细胞、B细胞等多种免疫效应细胞都能促其活化和增强对病原微生物的杀伤能力[11]。,LAK细胞则是一种由淋巴因子活化的杀瘤谱最广、效应最强的杀伤细胞，它只杀伤肿瘤、不杀伤正常细胞。近年已有较多应用LAK细胞和IL-2治疗恶性肿瘤的报道。由此可见，该药可能是通过增强机体对肿瘤的免疫功能而实现其抗癌作用的。
2.在抗肿瘤方面的研究
2.1肝癌
华蟾素注射液能够抑制HepG-2细胞增殖，影响DNA拓扑异构酶Ⅰ酶的mRNA表达及活性,从而有效抑制肝癌[12]。陈华[13]等采用噻唑蓝还原法（MTT）观察华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响；采用流式细胞术（FCM）检测对HepG-2细胞周期的影响；采用RT-PCR法检测对HepG-2细胞TOPOⅠmRNA表达的影响；采用TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋反应检测华蟾素对TOPOⅠ酶活性的影响；采用负超螺旋PBR322DNA检测华蟾素对DNA的直接抑制作用。结果，华蟾素注射液对HepG-2细胞增殖具有抑制作用，其抑制效应具有时间和剂量依赖性；并将HepG-2细胞阻滞于S期；RT-PCR检测表明，华蟾素注射液可下调TOPOⅠmRNA表达，表现浓度依赖效应；对TOPOⅠ介导的负超螺旋PBR322DNA解旋反应有抑制作用；对负超螺旋PBR322DNA没有直接抑制作用。
2.2肺癌
龚海健[14]选择2006年2月-20l0年2月就诊的非小细胞肺癌患者28例(男15／女13)，用多西紫杉合并华蟾素注射液治疗，结果临床有效率为32.14％(9／28)。在治疗期间发生血液学毒副反应8例，全部为Ⅱ度以下，非血液学毒副反应20例，除1例脱发、1例恶心呕吐毒副反应发生Ⅲ度外，其余非血液学毒副反应均为Ⅱ度以—化疗期间患者能保持较高的生活质量，且毒副反应较轻，患者可以耐受.提示多西紫杉合并华蟾素注射液治疗非小细胞肺癌患者能够有效的提高近期疗效和改善患者近期生活质量。
2.3食管癌
《中国实验方剂学杂志》曾报道[15]，将70例食管癌患者随机分成对照组和治疗组2组，每组各35例，对照组采用化疗(ND)方案单纯化疗法，用含去甲长春花碱(NVB)联合顺氯氨铂(DDP)化疗；治疗组采用联合化疗法，化疗方案与对照组相同，并每天用20mL华蟾素注射液加入500mL5％的葡萄糖注射液，采用静滴方式给药，I周期21d计，每组患者进行2周期的治疗。2周期治疗后分别以近期疗效、不良反应及生存质量3项作为评价指标，来评价疗效。结果：治疗组和对照组的有效率分别为62.8％，48.5％，经统计分析有显著性差异(P<0.01)；生存质量的改善程度也具有显著性差异(P<0.01)；治疗组的不良反应发生率低于对照组。由此得出结论华蟾素注射液联合化疗对中晚期食管癌患者化疗的疗效较好，同时降低了不良反应的发生率，改善了患者的生存质量，提示华蟾素联合化疗治疗食管癌值得在临床上进一步推广应用。
2.4膀胱癌
《细胞与分子免疫学杂志》[16]曾报道一篇关于华蟾素诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究，实验员采用MTT法测定华蟾素对体外膀胱癌细胞的抑制作用，倒置显微镜、TUNEL法观察细胞形态变化，用流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期的变化；半定量RT-PCR法检测凋亡相关基础Bcl-2、bax、caspase-3mRNA表达的变化，比色法测定caspase-3活性变化。结果，MTT法显示，华蟾素对膀胱癌细胞有显著的增殖抑制作用与华蟾素的浓度和作用时问有关，0.2mg／L华蟾素作用72h可以杀死50％以上的细胞；可诱导BIU87细胞凋亡，细胞周期停滞在S-和G2期；凋亡相关基因Bcl-2表达减少，bax无明显变化，caspase-3表达及活性增高。由此得出结论华蟾素在体外有较强的抗膀胱癌作用，细胞凋产的发生可能与细胞周期阻滞，Bcl-2和caspase-3基因表达及活性变化有关。
2.5胰腺癌
《上海中医药杂志》[17]曾报道，将胰腺癌SWl990裸小鼠随机分为华蟾素纽和生理盐水组，分别予腹腔注射华蟾素注射液和氯化钠注射液，共21d。实验结束时，随取两组瘤块组织，应用基因表达谱芯片检测肿瘤组织相关基冈的表达。结幕华蟾素作用3周后表达量上调比值大于6的差异基因丰要为复制蛋白A、抑瘤素M受体、死亡受体配体基因；下调比值大于6的差异基因主要为细胞内激酶网络成员的蛋白激酶如蛋白磷酸激酶、酪氨酸蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶、丝氨酸，苏氨酸激酶等。结论华蟾素有可能通过上调复制蛋白A，抑瘤素M受体、死亡受体配体基因表达，促进肿瘤细胞的死亡和凋亡：也可能选择性抑制细胞信号转导通路特别是MAPK通路中的关键酶，如蛋白酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶等基因来发挥其有效的抗肿瘤特性。
2.6乳腺癌
《中国药理学通报》[18]曾报道，王玲，刘世坤等人用MTT法检测药物细胞毒性作用及耐药细胞逆转倍数，高效液相色谱法检测细胞内ADM的浓度，流式细胞术测定P一糖蛋的表达。结果，华蟾素15mg•L“能增加MCF-7／ADM细胞对ADM的敏感性，使ADM的半数抑制浓度(IC50)由38.14mg•L-1。降至12。93“g•L-1；能提高ADM在MCF-7／ADM细胞内的浓度，降低MCF-7／ADM细胞P-gP的表达。结论研究表明华蟾素能部分逆转MCF-7／ADM细胞的MDR，其机制与抑制P-gP的功能与表达，增加细胞内ADM的含量有关。
2.7胆管癌
《中国中西医结合外科杂志》[19]曾报道，刘玮等用流式细胞仪检测华蟾素对QBC939细胞凋亡的作用，RT-PcR法研究华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939Fas及caspase-3mRNA表达变化的影响。结果，不同浓度华蟾素作用于QBc939细胞48h后，流式细胞仪分析显示，凋亡细胞明显增多，与对照组相比有显著性(P<0.001)。RT-PcR结果显示：‰、c踮pase一3mRNA表达实验组与对照组相比增强(P<0.001)。由此得出结论，华蟾素作用于人胆管癌细胞株QBC939，促进其细胞凋亡，而这一作用的实现可能与Fas及caspase-3mRNA表达的上调有关。
2.8卵巢癌
《国际中医中药杂志》[20]曾报道，用体外培养卵巢癌3AO细胞，不同浓度的华蟾素干预后，应用RT-PCR检测CD44smRNA的表达，流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果，卵巢癌3AO细胞对照组CD44smRNA表达为1.3±0.1，细胞凋亡率为(2.31±0.98)％；0.25mg／ml华蟾素对卵巢癌3AO细胞CD44smRNA和凋亡率的影响较对照组，无显著性差异(P>0.05)：2.5mg／ml华蟾素干预后，3AO细胞CD44smRNA表达为1.0±0.1，癌细胞凋亡率为(28.69±4.16)％，较对照组有显著性差异(P<0.05)：25mg•ml_1华蟾素与2.5mg•ml-1华蟾素对卵巢癌3AO细胞CD44smRNA表达和凋亡率的影响无显著性差(P>0.05)，较对照组有显著性差异伊<0.05)。由此得出结论，2.5mg•ml-1。华蟾索可有效抑制卵巢癌3AO细胞CD44s的表达，抑制癌细胞的侵蚀性生长。
2.9消化道恶性肿瘤
《现代肿瘤医学》[21]曾报道，为观察华蟾素注射液联合希罗达治疗晚期消化道恶性肿瘤的疗效。黄景玉等将患者随机分为两组，治疗组30例采用华蟾素注射液20ml+5％葡萄糖500ml，静滴，每日1次，连用15天；希罗达lg-1.5g，每日两次，口服，连用14天。对照组30例用希罗达lg-1.5g，1日两次，口服，连用14天。2l天为1周期，共用2周期。结果，治疗组有效率为：53.3％，疼痛缓解率为63.3％；对照组有效率46.7％，疼痛缓解率为56.7％；两组相比治疗组优于对照组，但差异未达显著性(P>0.05)。治疗组生活质量改善率为73.3％，白细胞下降率为16.8％；对照组生活质量改善率为26.7％，白细胞下降率为46.7％；两组相比均有显著差异(P<0.05)。由此得出结论，华蟾素注射液配合希罗达治疗晚期消化道恶性肿瘤能明显缓解症状，改善生活质量，疗效确切。
2.10人胶质瘤细胞
《齐齐哈尔医学院学报》[22]曾报道，赵志远用平皿克隆形成法测定不同浓度华蟾素对U251细胞锚定依赖性生长能力的影响；使用WesterBlot法观察不同浓度华蟾素处理人胶质瘤细胞48小时后，Bcl-2、Bax蛋白表达变化情况。结果，平皿克隆法显示：华蟾素抑制人胶质瘤细胞U251生长，呈剂量依赖性；WesterBlot显示随着药物浓度升高，华蟾素可以逐渐抑制BCL-2的蛋白表达，活Bax蛋白表达。由此得出结论，华蟾素有诱导人胶质瘤细胞U251细胞凋亡的作用，其机制可能BCL-2／Bax比值的下调，促进细胞凋亡有关。
3.展望
由于华蟾素具有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡和刺激免疫系统的多重作用，目前在肿瘤临床治疗上已广泛应用。对晚期癌症患者，特别是失去手术、放疗条件及不能接受化疗的病人来说，是一种有希望的抗癌药物，可明显提高患者的生存质量及延长生存期。在肿瘤的放、化疗过程中联合应用，能减少其毒副作用，增强患者对放、化疗的耐受性，并且对肿瘤细胞的MDR有一定程度的改善，提高肿瘤细胞对放、化疗产生的凋亡诱导作用的敏感性，从而提高疗效或在相同疗效下减少放、化疗的剂量。通过对其生物活性的研究，如果能进一步确定其主要药理活性和作用机制及其对凋亡相关基因的影响，同时针对华蟾紊抗肿瘤特点加强联合用药、剂量、方法的研究，更能充分发挥传统中药在抗肿瘤方面的独特效用，为临床治疗肿瘤提供新的理论依据及新的思路，使其成为新一代高效、低毒的抗癌药物。华蟾素既可单药用于治疗肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤，亦可与化、放疗联合应用，起到增效、减毒的作用。此外，华蟾素还能用于治疗癌性疼痛及其他一些肿瘤相关病症，而且毒副作用较小，迄今未见与药物治疗相关的死亡报道，是一种较有前途的、安全有效的抗肿瘤中药制剂，值得进一步深入研究。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社2000：附录26.
[2]刘莉，蒋亚生，张士华，等.抗癌中药制剂局部注射对裸鼠人肝癌细胞核DNA含量的影响.中国肿瘤临床1993；20(2)：140.142.
[3]关钧，赵学海.华蟾素抗肿瘤作用机理的初步探讨.蚌埠医学院学报1993；18(2)：78-81.
[4]JingY,OhizumiH,KawazoeN,etal.Selectiveinhibitoryeffectofbufalinongrowthofhumantumorcellsinvitro:AssociationwiththeinductionofapoptosisinleukemiaHL-60cells[J].JpnJCanceRes,1994,85(6):645-651.
[5]YamadaK.HinoK.TomoyasuS，etal.Enhancementbybufalinofretinoicacid.induceddifferentiationofacutepromyeloeyticleukemiacellsinprimaryculture.LeukRes1998；22(7)：589-595.
[6]LeeDY.YasudaM.YamamotoT,etal.Bufalininhibitsendothelialcellproliferationandangiogenesisinvitro.LifeSci1997；60(2)：127-134.
[7]EfferthT，DaveyM，OlbfichA，etal.ActivityofdragsfromtraditionalChinesemedicinetowardsensitiveandMDRlorMRPIoverexpressionmultidrug-resistanthumanCCRF.CEMleukemiacells.BloodCellsMoleculesandDiseases2002；28(2)：160-168.
[8]PackhamG,Cleveland,JI.C-Mycandapoptosis[J].BiochemBiophysActa,1995,1242(1):11-28.
[9]林培英，潘竞锵，冯昭明,等.华蟾素对小鼠免疫功能的影响[J].中成药研究，1987,12:20-21.
[10]赵兴梅，陈明，杨祖贻，等.华蟾素对人IL-2水平及LAK活性影响[J].中药药理与临床，1991,15（6）：333.
[11]王在国，张爱玲，丁福全，等.经埋植式给药装置肝动脉门静脉输注自体LAK细胞及化疗药治疗中晚期肝癌[J].新消化病杂志，1996,4(8):448.
[12]蒋芹，卞保强，张为民，等.华蟾素治疗晚期原发性肝癌的临床研究.临床肿瘤学杂志.2000.5(4)：294.
[13]陈华孙宇崔晓楠.华蟾素注射液对人肝癌HepG-2细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ的影响.中国癌症杂志.2010,20(3):197-201.
[14]龚海健.多西紫杉合并华蟾素注射液治疗非小细胞肺癌的疗效评价.当代医学.2011,17(7):154.
[15]刘怀民.郑玉玲.刘晓莉.杨旭初华蟾素联合化疗治疗中晚期食管癌[期刊论文]-中国实验方剂学杂志2011(5).
[16]苏劲，许志坚，叶木石.华蟾素诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究.2009,25(4):351-353.
[17]朱晓燕，孟志强，陈震，沈晔华，于尔辛，刘鲁明.上海中医药杂志.2008,42(11):71-74.
[18]王玲，刘世坤，周于禄，裴奇.华蟾素对人乳腺癌细胞阿霉素多药耐药性的逆转作用.中国药理学通报.200723(5)：677—680.
[19]刘玮，齐自宁.华蟾素对人胆管癌细胞系QBC939的作用.2008,14(3):251-254.
[20]王绍光，姜学强.华蟾素对卵巢癌3AO细胞CD44s表达的影响.2008,30(6):405-406.
[21]黄景玉，赵志华，樊青霞.华蟾素联合希罗达治疗晚期消化道恶性肿瘤.2009,17(3):498-499.
[22]赵志远.华蟾素诱导人胶质瘤细胞U251凋亡的作用机制研究.2012,33(1):7-8.