本文主要研究内容
作者侯倩倩（2019）在《外源基因在产甘油假丝酵母中的表达策略及应用研究》一文中研究指出：产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）作为甘油高效工业化生产菌株,拥有独特的耐高渗透压、耐高温高糖、耐有机酸等抗逆性强特点,是潜在的合成生物学底盘工业微生物。该菌株在遗传与分子生物学方面研究仍有许多空白,阻碍了对其工业应用潜力的开发。酵母作为外源基因表达的重要真核表达系统之一,影响基因表达的因素有很多。本研究从密码子偏好性、启动子、mRNA二级结构等对外源基因在该菌株中表达策略进行研究,旨在为工业抗逆酵母改造、生产高附加值产品提供基础,本论文研究具体如下:为从密码子偏好性优化外源基因表达,研究利用Codon-W分析C.glycerinogenes密码子使用情况,结果发现,C.glycerinogenes平均GC含量为40.3%,GC3s平均含量为37.2%,最优密码子有25个且多以A/U结尾;通过表达不同来源外源基因GFP、ldhA、xylB、xylD、kivD发现:GFP、ldhA密码子偏好与宿主相似,易于成功表达,而xylB、xylD、kivD的GC含量均大于65%,密码子多以G/C结尾,CAI值均约为0.2,ENc值都在40以上,基因只转录不表达,只有在密码子优化后才成功表达;结果表明,利用密码子同义突变优化外源基因,减小GC含量和ENc值,提高CAI值,能够调控基因在C.glycerinogenes中的表达效率。基于启动子表达策略,进一步研究不同启动子对GFP、xylB和ldhA表达影响,具体为:从C.glycerinogenes中选择5个组成型启动子PGAP、PPDC、PPGK1、PCS1和PLSC2表达GFP,PGAP启动强度最强,其次为PPDC和PPGK1;利用低pH诱导型启动子PGMT1、PGUK1和组成型启动子PGAP、PPDC、PPGK1表达xylB和ldhA,发现组成型启动子调控表达基因在pH 5.0和4.0时无明显变化,pH 3.0时明显下降,低pH诱导型启动子PGMT1表达的xylB和ldhA转录水平pH 2.5相比pH 5.5分别提高14.3倍和23.3倍,导致木糖酸和乳酸产量分别提高2.6倍和3.2倍;研究显示,C.glycerinogenes作为宿主可对不同外源基因采用不同启动子表达策略,可实现外源基因进行表达量控制。以GFP和密码子优化后xylB为研究对象,探索在C.glycerinogenes中翻译起始区附近二级结构最小自由能变化和拷贝数的表达策略,研究发现,GFP翻译起始区二级结构ΔG0=-3.3 Kcal·mol-1降至ΔG12=-12.0 Kcal·mol-1时荧光强度降低49.6%,而ΔG4=-6.3Kcal·mol-1的碱基配对概率相比ΔG0减小,荧光强度提高31.1%;xylB翻译起始区二级结构ΔG0=-6.2 Kcal·mol-1升至ΔG1=-2.4 Kcal·mol-1时,减弱了mRNA二级结构稳定性,碱基处于配对的概率减小,表达的酶活提高40.4%;增加外源基因拷贝数使重组菌C.g-6GFP荧光强度是单拷贝的3.9倍,C.g-4xylB01酶活和xylB转录水平分别是单拷贝的1.5倍和2.8倍,木糖酸的产量达到24.5 g·L-1,而6个xylB拷贝数时酶活和转录水平相比4个时降低35.7%和36.5%;结果表明,通过改变外源基因翻译起始区二级结构的最小自由能和优化拷贝数在一定程度上可以控制外源基因在C.glycerinogenes中的表达量。
Abstract
chan gan you jia si jiao mu （Candida glycerinogenes）zuo wei gan you gao xiao gong ye hua sheng chan jun zhu ,yong you du te de nai gao shen tou ya 、nai gao wen gao tang 、nai you ji suan deng kang ni xing jiang te dian ,shi qian zai de ge cheng sheng wu xue de pan gong ye wei sheng wu 。gai jun zhu zai wei chuan yu fen zi sheng wu xue fang mian yan jiu reng you hu duo kong bai ,zu ai le dui ji gong ye ying yong qian li de kai fa 。jiao mu zuo wei wai yuan ji yin biao da de chong yao zhen he biao da ji tong zhi yi ,ying xiang ji yin biao da de yin su you hen duo 。ben yan jiu cong mi ma zi pian hao xing 、qi dong zi 、mRNAer ji jie gou deng dui wai yuan ji yin zai gai jun zhu zhong biao da ce lve jin hang yan jiu ,zhi zai wei gong ye kang ni jiao mu gai zao 、sheng chan gao fu jia zhi chan pin di gong ji chu ,ben lun wen yan jiu ju ti ru xia :wei cong mi ma zi pian hao xing you hua wai yuan ji yin biao da ,yan jiu li yong Codon-Wfen xi C.glycerinogenesmi ma zi shi yong qing kuang ,jie guo fa xian ,C.glycerinogenesping jun GChan liang wei 40.3%,GC3sping jun han liang wei 37.2%,zui you mi ma zi you 25ge ju duo yi A/Ujie wei ;tong guo biao da bu tong lai yuan wai yuan ji yin GFP、ldhA、xylB、xylD、kivDfa xian :GFP、ldhAmi ma zi pian hao yu su zhu xiang shi ,yi yu cheng gong biao da ,er xylB、xylD、kivDde GChan liang jun da yu 65%,mi ma zi duo yi G/Cjie wei ,CAIzhi jun yao wei 0.2,ENczhi dou zai 40yi shang ,ji yin zhi zhuai lu bu biao da ,zhi you zai mi ma zi you hua hou cai cheng gong biao da ;jie guo biao ming ,li yong mi ma zi tong yi tu bian you hua wai yuan ji yin ,jian xiao GChan liang he ENczhi ,di gao CAIzhi ,neng gou diao kong ji yin zai C.glycerinogeneszhong de biao da xiao lv 。ji yu qi dong zi biao da ce lve ,jin yi bu yan jiu bu tong qi dong zi dui GFP、xylBhe ldhAbiao da ying xiang ,ju ti wei :cong C.glycerinogeneszhong shua ze 5ge zu cheng xing qi dong zi PGAP、PPDC、PPGK1、PCS1he PLSC2biao da GFP,PGAPqi dong jiang du zui jiang ,ji ci wei PPDChe PPGK1;li yong di pHyou dao xing qi dong zi PGMT1、PGUK1he zu cheng xing qi dong zi PGAP、PPDC、PPGK1biao da xylBhe ldhA,fa xian zu cheng xing qi dong zi diao kong biao da ji yin zai pH 5.0he 4.0shi mo ming xian bian hua ,pH 3.0shi ming xian xia jiang ,di pHyou dao xing qi dong zi PGMT1biao da de xylBhe ldhAzhuai lu shui ping pH 2.5xiang bi pH 5.5fen bie di gao 14.3bei he 23.3bei ,dao zhi mu tang suan he ru suan chan liang fen bie di gao 2.6bei he 3.2bei ;yan jiu xian shi ,C.glycerinogeneszuo wei su zhu ke dui bu tong wai yuan ji yin cai yong bu tong qi dong zi biao da ce lve ,ke shi xian wai yuan ji yin jin hang biao da liang kong zhi 。yi GFPhe mi ma zi you hua hou xylBwei yan jiu dui xiang ,tan suo zai C.glycerinogeneszhong fan yi qi shi ou fu jin er ji jie gou zui xiao zi you neng bian hua he kao bei shu de biao da ce lve ,yan jiu fa xian ,GFPfan yi qi shi ou er ji jie gou ΔG0=-3.3 Kcal·mol-1jiang zhi ΔG12=-12.0 Kcal·mol-1shi ying guang jiang du jiang di 49.6%,er ΔG4=-6.3Kcal·mol-1de jian ji pei dui gai lv xiang bi ΔG0jian xiao ,ying guang jiang du di gao 31.1%;xylBfan yi qi shi ou er ji jie gou ΔG0=-6.2 Kcal·mol-1sheng zhi ΔG1=-2.4 Kcal·mol-1shi ,jian ruo le mRNAer ji jie gou wen ding xing ,jian ji chu yu pei dui de gai lv jian xiao ,biao da de mei huo di gao 40.4%;zeng jia wai yuan ji yin kao bei shu shi chong zu jun C.g-6GFPying guang jiang du shi chan kao bei de 3.9bei ,C.g-4xylB01mei huo he xylBzhuai lu shui ping fen bie shi chan kao bei de 1.5bei he 2.8bei ,mu tang suan de chan liang da dao 24.5 g·L-1,er 6ge xylBkao bei shu shi mei huo he zhuai lu shui ping xiang bi 4ge shi jiang di 35.7%he 36.5%;jie guo biao ming ,tong guo gai bian wai yuan ji yin fan yi qi shi ou er ji jie gou de zui xiao zi you neng he you hua kao bei shu zai yi ding cheng du shang ke yi kong zhi wai yuan ji yin zai C.glycerinogeneszhong de biao da liang 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的侯倩倩，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于产甘油假丝酵母论文,外源基因论文,表达策略论文,密码子论文,启动子论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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