论文摘要
基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）又称CXCL12,属于趋化因子CXC亚家族,是由骨髓基质细胞及其他相关上皮细胞和间质细胞分泌的一种趋化蛋白。其与受体CXCR4结合后,在胚胎发育、血管生成、造血、干细胞迁移、炎症及肿瘤等多种生理或病理过程中发挥重要作用。本实验检测小细胞肺癌细胞株NCI-H446上的CXCR4表达,研究SDF-1对其增殖及侵袭能力及VEGF和MMP-9分泌的影响,并通过应用CXCR4特异性抑制剂、PI3K抑制剂及siRNA技术,探讨SDF-1/CXCR4轴在小细胞肺癌侵袭转移中的作用机制和信号传导通路,为小细胞肺癌的免疫治疗提供新的思路。第一部分SDF-1/CXCR4与小细胞肺癌增殖、粘附和侵袭能力关系的研究目的:探讨SDF-1与受体CXCR4结合后对肿瘤侵袭能力的影响及PI3K信号通路的作用,为小细胞肺癌的分子靶向治疗奠定实验基础。方法:采用流式细胞术（FCM）、RT-PCR检测NCI-H446上的CXCR4表达,运用CCK-8法分别测SDF-1、CXCR4特异性拮抗剂AMD3100及PI3K抑制剂LY294002对其增殖的影响。粘附及侵袭实验分五组:对照组（SDF-1阴性组）;SDF-1 50ng/ml处理组;SDF-1 100ng/ml处理组;SDF-1（100ng/ml）+AMD3100处理组;SDF-1（100ng/ml）+LY294002处理组,分别进行粘附实验、transwell趋化侵袭实验,以观察不同条件处理后的各组细胞的粘附和侵袭能力变化。结果:FCM分析表明NCI-H446细胞系高表达CXCR4（91.6±2.1%）。SDF-1、AMD3100对H446生长无促进及抑制作用。与对照组相比,LY294002（20μmol/L）对NCI-H446增殖有抑制作用, 24h、48h、72h抑制率分别为19.4%、31.3%、18.4%。就对照组而言,100ng/ml的SDF-1使NCI-H446的粘附能力增强,OD值为1.253±0.107 VS 0.783±0.071（P<0.05）;侵袭能力增强,transwell趋化侵袭实验穿膜细胞数为83.2±15.7 VS 30.8±6.5（P<0.001）。而与SDF-1 100ng/ml处理组相比,AMD3100及LY294002能抑制其粘附及侵袭能力,OD值分别为0.759±0.088 VS 1.253±0.107,0.652±0.076 VS 1.253±0.107（P均<0.05）,transwell趋化侵袭实验穿膜细胞数为37.8±5.1 VS 83.2±15.7,37.6±7.2 VS 83.2±15.7（P均<0.001）。结论:小细胞肺癌细胞株NCI-H446高表达趋化因子CXCR4,其配体SDF-1能促进其粘附及侵袭能力,CXCR4特异性拮抗剂AMD3100能抑制SDF-1的作用,PI3K信号通路参与其增殖,并在SDF-1/CXCR4结合引起NCI-H446的粘附及侵袭中发挥作用。第二部分SDF-1/CXCR4对小细胞肺癌表达VEGF及MMP-9的影响目的:研究SDF-1、AMD3100和LY294002干预对NCI-H446表达VEGF及MMP-9的影响,探讨SDF-1改变小细胞肺癌侵袭能力的作用机制。方法:实验分5组:对照组（SDF-1阴性组）;SDF-1 50ng/ml处理组;SDF-1 100ng/ml处理组;SDF-1（100ng/ml）+AMD3100处理组;SDF-1（100ng/ml）+LY294002处理组。无血清培养基培养24小时,采用RT-PCR法测细胞的VEGF及MMP-9的表达,ELISA法测细胞培养上清VEGF及MMP-9的浓度,以观察不同处理条件的VEGF及MMP-9表达。结果:RT-PCR检测提示各组均能扩增出VEGF及MMP-9基因的表达,SDF-1处理组细胞上清的VEGF及MMP-9浓度较对照组增加,且能被AMD3100及LY294002抑制。与对照组相比,SDF-1 100ng/ml处理组上清VEGF及MMP-9浓度明显升高,[（826±102）pg/ml VS （360±21）pg/ml], [（105±4） pg/ml VS （30±9）pg/ml]（P均<0.05）;与SDF-1 100ng/ml处理组相比,SDF-1（100ng/ml）+AMD3100处理组、SDF-1（100ng/ml）+LY294002处理组VEGF浓度下降,[（224±55） pg/ml VS （826±102） pg/ml], [（379±87） pg/ml VS （826±102）pg/ml]（P均<0.05）;MMP-9浓度也下降,[（31±2） pg/ml VS （105±4） pg/ml], [（25±4） pg/ml VS （105±4）pg/ml]（P均<0.05）。结论:小细胞肺癌细胞株NCI-H446在SDF-1的刺激下,VEGF及MMP-9的表达量明显增加,能够被AMD3100及LY294002抑制,推测SDF-1促进小细胞肺癌的侵袭及转移与VEGF及MMP-9的分泌增加有关。目的:研究CXCR4-siRNA对小细胞肺癌细胞NCI-H446体外侵袭力的影响。方法:根据siRNA的设计原则化学合成CXCR4特异性siRNA,用脂质体转染NCI-H446细胞,采用RT-PCR法及Western Blot法检测CXCR4mRNA及蛋白水平的变化。用transwell小室模型检测转染后细胞体外侵袭能力的变化,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化。结果:转染CXCR4-siRNA后,CXCR4mRNA和蛋白表达水平明显下降,细胞体外侵袭能力明显减弱,与空脂质体转染组相比,CXCR4-siRNA转染组transwell趋化侵袭实验穿膜细胞数为32.3±3.8 VS 62.1±8.2（P<0.001）,CXCR4-siRNA对NCI-H446细胞增殖无影响。结论:特异的siRNA能够有效下调CXCR4基因,降低小细胞肺癌细胞的体外侵袭能力。