骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病胶原重塑影响的实验研究

论文摘要

目的：探讨经外周静脉途径移植骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）治疗扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM）心衰的可行性及对胶原重塑的影响。方法：1.扩张型心肌病心衰动物模型的构建与鉴定选取体质量为240-290g的8周龄、SPF级近交系雄性SD大鼠85只,分为2组：DCM组（n=65）、正常对照组（n=20）。DCM组采用腹腔注射多柔比星（adriamycin, ADR,阿霉素）的方法（每次2.5mg/kg,1次/周,共6周,累积剂量15mg/kg）构建DCM心衰模型；正常对照组以等容积的生理盐水代替ADR进行腹腔注射。给药第10周对两组大鼠行心脏超声检查,观察左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率。给药第10周末每组大鼠任取10只处死后,行心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织I、Ⅲ型胶原表达。2.骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定选取体质量为50-70g的3周龄SPF级近交系雄性SD大鼠,收集双侧股骨、胫骨之骨髓,采用直接贴壁培养法体外分离、培养MSCs,观察细胞形态,并对其进行纯化、扩增。传至第三代,进行免疫荧光检测。3.骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病将DCM组大鼠分为细胞移植组（n=13）、移植对照组（n=13）、DCM空白组（n=12）。细胞移植组经尾静脉注射含MSCs的细胞悬液,每次细胞数量5×106/只,注射容积为0.5ml,共移植10次,隔日一次；移植对照组予以不含MSCs的无血清培养基注射,注射容积与方法同细胞移植组；DCM空白组不予任何干预。正常对照组（n=10）亦不予任何干预。四组大鼠均置于同等条件下饲养。于细胞移植前、末次移植后第5周及第10周分别进行心脏超声检查,观察左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率。于末次移植后第10周末将四组大鼠全部处死后,行心肌组织HE、Masson病理染色、心肌胶原分析及免疫组化检测心肌组织I、Ⅲ型胶原表达。结果：1.扩张型心肌病心衰动物模型的构建与鉴定经ADR腹腔注射后,DCM组大鼠逐渐出现不同程度的紫绀、水肿、活动量减少、进食量下降等心衰表现。心脏超声检查显示DCM组大鼠心腔扩大,室壁活动度弥漫性减弱,左室舒张末期内径、左室收缩末期内径显著大于正常对照组[（7.1±0.3）mmvs.（5.7±0.2）mm,（4.9±0.2）mm vs.（2.8±0.1）mm,P<0.05],而左室射血分数、左室短轴缩短率显著低于正常对照组[（66.3±1.3）%vs.（88.6±0.6）%,（30.4±0.9）%vs.（51.6±0.8）%,P<0.05]。DCM组大鼠心肌组织HE染色显示心肌纤维排列紊乱,部分心肌纤维正常结构消失,细胞核深染,可见炎性细胞浸润；心肌组织Masson染色可见大量蓝染的胶原纤维,与染成红色的心肌纤维交错排列。心肌胶原分析显示DCM组大鼠心肌胶原容积分数为（28.24±1.28）%,明显高于正常对照组（3.16±0.51）%,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化检测显示DCM组大鼠心肌细胞间质中可见大量棕褐色的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达；DCM组心肌Ⅰ/Ⅲ型胶原比值（1.34±0.02）大于正常对照组（1.10±0.02）,两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。2.骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定刚贴壁的细胞呈三角形、纺锤形或多角形。随着细胞传代,贴壁细胞形态渐趋于均匀一致,且排列有序,具有一定的方向性。传至第二代后,贴壁细胞的生长呈现形态单一的漩涡状盘旋排列。通过免疫荧光法检测第三代细胞,发现细胞表面CD44抗原呈阳性表达,而CD34抗原呈阴性表达,符合MSCs的细胞表面抗原特征,并结合细胞贴壁的特性及形态学观察,可以明确为MSCs。3.骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病细胞移植组大鼠通过静脉注射MSCs后,一般情况好转,紫绀、水肿、活动量减少、进食量下降等心衰表现明显改善。末次移植后第10周心脏超声检查显示：细胞移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径[（6.3±0.2）mm,（3.7±0.1）m]明显低于移植对照组[（7.1±0.3）mm,（5.0±0.2）mm]和DCM空白组[（7.1±0.2）mm,（5.0±0.1）mm]（P<O.05）,而左室射血分数、左室短轴缩短率[（79.6±1.7）%,（41.2±1.7）%]明显高于移植对照组[（65.7±0.9）%,（30.0±0.6）%]和DCM空白组[（66.1±0.9）%,（30.3±0.6）%]（P<0.05）。心肌组织HE染色显示：细胞移植组心肌纤维的形态结构较移植对照组和DCM空白组明显改善,其中可见移植细胞存活,其细胞核浓染,核浆比例较正常心肌细胞大。心肌组织Masson染色显示：与移植对照组和DCM空白组相比,细胞移植组蓝染的胶原纤维明显减少,代之以染成红色的心肌纤维。心肌胶原分析显示细胞移植组大鼠心肌胶原容积分数为（15.92±0.99）%,明显低于移植对照组（29.25±1.21）%和DCM空白组（29.28±1.16）%,差异具有统计学意义（P<O.05）。免疫组化检测显示细胞移植组大鼠心肌间质内增生的Ⅰ、Ⅲ型胶原较移植对照组和DCM空白组明显减少；细胞移植组心肌Ⅰ/Ⅲ型胶原比值（1.23±0.02）小于移植对照组（1.35±0.02）和DCM空白组（1.35±0.02）,差异具有统计学意义（P<O.05）。结论：1.通过ADR分次小剂量腹腔注射的方法（每次2.5mg/kg,1次/周,共6周,累积剂量15mg/kg）可成功建立与临床上DCM病理及病理生理过程高度一致的经典DCM心衰大鼠模型。2.采用直接贴壁筛选法从大鼠骨髓中成功分离出MSCs,并在体外进行MSCs的纯化与扩增,通过细胞生长特性、形态学观察及免疫荧光法检测,证实所分离培养的细胞为MSCs。3.经外周静脉途径重复多次移植体外培养、扩增的同种异体MSCs,可通过减轻DCM心衰大鼠心肌胶原网络的重塑,从而在一定程度上改善其心功能。

论文目录

• 英汉缩略词对照表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分：扩张型心肌病心衰动物模型的构建与鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分：骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分：骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述：骨髓间充质干细胞移植治疗扩张型心肌病研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介