OsHsp82基因的克隆、分析及互作蛋白研究

论文摘要

热激蛋白（Hsp）是一类在热激条件下大量合成的蛋白质,并与植物体高温、低温、干旱等逆境应答以及植物的生长发育密切相关。其中,Hsp90家族蛋白是一类分子量为80～90kD的Hsp蛋白质。它们具有帮助蛋白质折叠,保持蛋白质结构完整等功能。Hsp90在进化上十分保守,真核生物中Hsp90同源性相差最远的也超过50%的同源性。Hsp90划分成3个区域:N端的ATP结合/水解区域,具有不同电荷的中间区域,以及能提供2聚化作用结合部位并含MEEVD保守末尾的C端区域。Hsp90的三个区域都能识别并结合不同蛋白质。近年来关于Hsp90的研究主要集中在哺乳动物中,并发现了越来越多的Hsp90结合蛋白。但对于植物Hsp90的研究相对较少。为了解植物Hsp90家族的在逆境反应过程中的作用,本文克隆了OsHsp82基因,在调查其逆境条件下的表达情况的基础上,克隆了OsHsp82的结合蛋白,以便更进一步分析其生理功能。主要结果如下:1.采用荧光差显（Fluorescent Differential Display,FDD）技术,比较分析了低温和干旱处理与未处理的水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAGE（含0.1%H.A.Yellow）再分离与大矩阵（macroarray）筛选相结合的方法,发现了一个与OsHsp82cDNA高度同源（＞95%）的差异片段,通过数据库比对分析克隆OsHsp82全长cDNA序列。通过氨基酸同源性比较,发现OsHsp82与玉米Hsp82（84.9%）、拟南芥Hsp90-2（90.7%）、大麦Hsp90（94.7%）同源性较高,且都在C端具有MEEVD片段。2.运用RT-PCR技术分析了OsHsp82在高温和低温处理条件下的表达情况,发现OsHsp82在这两种逆境胁迫下均能被诱导,但在高温条件下OsHsp82的诱导更为迅速和强烈。说明OsHsp82与水稻在高温和低温胁迫下的应答有密切关系。3.运用酵母双杂交技术,以OsHsp82为诱饵蛋白,从水稻低温和干旱cDNA文库中筛选出了7个结合蛋白基因,这7个基因编码的蛋白分别是:水稻PRP1蛋白、水稻RBBI3-3蛋白、水稻光和系统Ⅱ10kD多肽、水稻CYP98蛋白和三个未知功能蛋白。并讨论了其中4个结合蛋白的功能,可能的结合模式以及可能参与的调节功能。4.构建了pGEx-Hsp82载体,并在体外表达、纯化了OsHsp82蛋白。同时构建了pET-RBBI3-3载体,得到了在体外表达的RBBI3-3蛋白。通过GST-pulldown系统做体外结合实验,但并未在体外检测到它们的结合,并对结果进行了分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.热激蛋白研究进展
• 1.1 热激生理
• 1.2 热激蛋白的发现
• 1.3 热激蛋白的分类
• 1.4 热激蛋白的功能
• 1.4.1 热激蛋白的保护作用
• 1.4.2 热激蛋白在植物发育中的作用
• 1.4.3 分子伴侣功能
• 1.5 热激蛋白基因的表达调控
• 2.Hsp90家族及其结合蛋白研究进展
• 2.1 Hsp90家族
• 2.2 Hsp90家族功能域
• 2.3 Hsp90家族结合蛋白
• 3.本实验的目的和意义
• 第二章.OsHsp82的克隆及表达分析
• 1、材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 RNA提取
• 1.2.2 RNA纯化
• 1.2.3 mRNA差异显示及基因片段克隆
• 1.2.4 感受态细胞的制备
• 1.2.5 DNA片段的连接
• 1.2.6 连接产物的转化
• 1.2.7 克隆的筛选以及阳性克隆的检测
• 1.2.8 测序质粒DNA的制备、PCR反应及序列测定
• 1.2.9 序列分析及cDNA克隆
• 1.2.10 RT-PCR
• 2.结果与分析
• 2.1 cDNA克隆与序列分析
• 2.2 OsHsp82氨基酸序列相似性分析
• 2.3 OsHsp82在不同逆境处理下的表达分析
• 3.小结
• 第三章 水稻Hsp82结合蛋白研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、菌株和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 pGBKT7-OsHsp82载体构建
• 1.2.2 酵母感受态细胞的制备
• 1.2.3 转化到酵母菌株AH109或Y187
• 1.2.4 检测DNA-BD融合基因的自身转录活性
• 1.2.5 检测诱饵蛋白对酵母的毒性
• 1.2.6 酵母共转化
• 1.2.7 pGEX-OsHsp82载体的构建
• 1.2.8 pET-RBBI3-3载体的构建
• 1.2.9 蛋白质体外诱导表达及检测
• 1.2.10 检测诱导蛋白可溶性
• 1.2.11 GST标签蛋白纯化
• 1.2.12 蛋白质体外结合
• 2.结果与分析
• 2.1 酵母双杂交结果与分析
• 2.2 体外结合实验结果
• 3.小结
• 第四章 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文