论文摘要
极端嗜热菌海栖热袍菌Thermotoga maritima所产p-葡萄糖苷酶（Tm-BglA）,具有良好的热稳定性和水解能力,在纤维素降解、食品风味的改善和大豆异黄酮生物转化等工业生产中具有重要的应用价值。本论文通过构建高效分泌表达耐热性p-葡萄糖苷酶工程菌以开发Tm-BgiA在食品加工和生物转化等方面的应用。通过基因工程手段,以枯草杆菌芽孢杆菌WB600的染色体DNA为模板,扩增得到淀粉酶（amyE）启动子和信号肽序列,大小为600bp的片段,把该片段插入到载体pET-20b（+）和穿梭载体pHY300PLK上,构建成功了三种不同的分泌表达载体pET-20b-Pamy、pET-20b-T7-Pamy和pHY-Pamy。将成功构建的质粒pET-20b-Pamy-bglA、pET-20b-T7-Pamy-bglA、pHY-Pamy-bglA、 pET-28a-thrombin-bglA和pET-20b-pelB-bglA,分别转化大肠杆菌JM109（DE3）表达,SDS-PAGE电泳分析显示发酵上清液中有明显的Tm-BglA蛋白条带。数据分析表明,在诱导培养36h以后发酵上清液中的目的蛋白均占总的目的蛋白的>50%,重组质粒pET-20b-Pamy-bglA除外,仅有0.18U/mL的Tm-BglA分泌到了发酵培养基中,占总酶活的12.37%。在Tm-BglA的N端插入一段含有23个氨基酸序列的短肽（thrombin）,构建得到分泌表达质粒pET-28a-thrombin-bglA,转化大肠杆菌JM109（DE3）后进行诱导表达,发酵培养60h时,Tm-BglA在发酵上清液中的酶活力为13.11U/mL,占总活力的67.63%。以上实验结果表明：β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中成功进行了分泌表达,并能正确折叠为有活性的天然蛋白结构,为大肠杆菌高效分泌表达系统的构建奠定了基础。SDS-PAGE电泳分析重组菌枯草芽孢杆菌WB600/pUY-Pamy-bglA发酵上清液中Tm-BglA的表达,结果表明,Tm-BglA成功实现了分泌表达。在培养时间达到60h,Tm-BglA在发酵上清液中的酶活力为6.61U/mL,占总活力的85.06%。成功的构建了枯草芽孢杆菌分泌表达工程菌。因枯草杆菌具有培养条件简单、生长迅速、无致病性、可以分泌多种酶和抗生素,并且具有良好的发酵基础特点,该研究结果为工业应用酶在食品领域中的应用奠定了基础。
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标签：耐热性葡萄糖苷酶论文; 启动子论文; 信号肽论文; 宿主论文; 分泌表达论文;