GeneFishing技术解析华南忍冬高钙环境下基因表达的差异

论文摘要

近年来,西南岩溶区生态的不断恶化,水土流失、石漠化加重,已严重制约当地经济的发展。利用基因工程进行石漠化修复是岩溶区植被恢复的重要手段,作为我国西南岩溶区典型植被之一的华南忍冬,研究其适应岩溶环境特别是岩溶高钙环境的适应机制,可以为基因工程修复石漠化提供重要的理论基础。本研究模拟华南忍冬的生长环境,通过GeneFishing技术分析不同浓度钙盐处理下的差异表达基因,并对其进行了表达量变化分析和验证。此外,利用生物信息学的手段对这些基因的功能进行了说明。本研究取得了以下成果:（1）建立了适用于华南忍冬的GeneFishing技术体系。采用2μg总RNA,通过反转录引物dT-ACP,42℃反应1 h,进行cDNA第一条链的合成,反转录时间不能太短。cDNA第一条链稀释5倍后用于GeneFishing PCR,PCR模板3μl,两步PCR的退后温度分别为50℃和65℃,PCR产物需在2%的琼脂糖凝胶中至少电泳1 h,才能获得较清晰地带。（2）通过GeneFishing技术分析了不同浓度钙离子（0和125 mg/L）处理下华南忍冬基因表达的差异,共使用了20对引物,发现了24个差异表达的基因（DEGs）。通过设计不同的引物,在6个不同浓度（0、25、50、75、100、125 mg/L）钙离子处理的材料中进行半定量PCR的验证,观察其表达量变化。（3）生物信息学方法分析DEGs在华南忍冬适应高钙环境过程中的作用。Blastn比对发现,24个DEGs中有1个编码通道蛋白,3个与光合作用相关,3个与蛋白质分选及分泌有关,5个与植物体内氧化还原反应有关,2个与植物营养和物质的合成有关,1个与转录因子有关,8个没有同源性或功能未知,大多数基因都曾报道过与盐胁迫密切相关。通过分析DEGs与钙靶蛋白的相互作用,发现DEGs与钙的靶蛋白有密切联系,说明也是受钙调控的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 华南忍冬简介
• 1.2 植物中与盐胁迫相关的基因研究进展
• 1.3 植物钙研究进展
• 1.4 基因差异表达的研究方法
• 1.5 GeneFishing 技术研究进展
• 1.6 课题的提出
• 1.7 研究目的与内容
• 2 GeneFishing 分析不同钙离子处理下华南忍冬基因的表达差异
• 2.1 实验材料、试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 华南忍冬总RNA 的提取
• 3.2 Genefishing 技术分析差异表达的基因片段
• 3.3 差异表达基因片段的同源性比对
• 3.4 半定量PCR 验证差异表达基因片段
• 4 讨论
• 4.1 关于 GeneFishing 技术的讨论?
• 4.2 关于钙相关基因的讨论
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录