水牛体细胞myostatin基因敲除的初步研究

论文摘要

水牛是我国南方主要的畜种,随着我国生产力水平的提高,水牛的役用性正在部分的被机械取代,而水牛的肉用性和乳用性得到越来越多的关注。myostatin是控制肌肉生长的一个关键基因,如若敲除该基因则能提高动物的产肉性能。为提高水牛的肉用性能,培育新的水牛品种,本研究对水牛体细胞myostatin基因敲除的可行性进行了初步探讨。 首先,根据GeneBank公布的奶牛myostatin基因序列设计了两对引物。利用长片段PCR技术从本地水牛的基因组中成功地得到了打靶用的长短同源臂,长度分别为4368bp和1374bp。测序及同源性分析表明,长短臂与奶牛相应序列的同源性达到97%和96%,说明扩增片段来源正确,完全可用于载体构建。同源长臂包括了myostatin基因的第一和第二外显子;同源短臂包括第三外显子的一部分。将同源长臂和短臂连入pLoxp骨架,构建成myostatin敲除载体—P13K。酶切及PCR鉴定结果证明载体构建正确。 然后,用经过改良的组织块法和胰酶消化法从水牛胎儿肌肉组织中成功分离得到水牛胎儿成纤维细胞,体外培养至第三代。 最后用构建的myostatin基因敲除载体通过脂质体法和电击法转染水牛胎儿成纤维细胞,获得了抗性细胞,并对转染参数和抗性细胞的筛选及培养条件进行了优化、获得的抗性细胞进行了PCR检测。结果表明:①用脂质体法转染时,脂质体8μl,质粒DNA2μg,稳定转染8h效率较高。电击法转染时,电场强度45V/mm,脉冲时间12ms时,转染效率较高;②抗性细胞使用DMEM+20%FBS+10μg/ml insulin+10ng/ml bFGF+30%条件液并采用微滴培养法培养效果较好;③P13K在抗性细胞中发生了随机整合。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 第一节 基因打靶的研究进展
• 1.1 基因打靶技术的产生和研究进展
• 1.2 基因打靶的理论基础
• 1.3 打靶载体设计
• 1.4 中靶细胞的筛选策略
• 1.5 中靶细胞的鉴定
• 1.6 影响基因打靶的因素
• 1.7 基因打靶技术存在的问题及对策
• 1.8 基因打靶技术的应用前景
• 第二节 肌肉生长抑制素基因的研究进展
• 2.1 myostatin基因的定位和结构
• 2.2 myostatin的同源性
• 2.3 myostatin的作用机理
• 2.4 myostatin的表达
• 2.5 myostatin的研究意义
• 2.6 展望
• 第二章 实验研究
• 第一节 myostatin敲除载体的构建
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与分析
• 1.3 讨论
• 第二节 外源DNA转染水牛胎儿成纤维细胞方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢