嗜热β-1，4-葡聚糖内切酶和酰基肽水解酶突变体的晶体结构和功能研究

论文摘要

来源于嗜热菌的酶类具有极好的高温反应活性和稳定性,在能源、化工、食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。解析嗜热酶及酶-底物复合物的晶体结构,研究其结构特征,将有助于揭示酶超常生物学稳定性以及高温催化反应机制的分子基础,为发掘嗜热酶的新功能、指导酶分子设计和改造等工作提供必要的理论依据。论文第一部分运用分子生物学技术克隆、表达、纯化了来源于嗜热菌Fervidobacterium nodosum Rt17-B1的嗜热β-1,4-葡聚糖内切酶FnCel5A及其N末端截短突变体FnCel5AND,并运用蛋白质晶体学的技术进行结晶,最终使用单波长反常散射法解析了分辨率达1.7 ?的FnCel5A和2.2 ?的复合物FnCel5AND:Glucose的晶体结构。结构分析表明,该酶具有糖基水解酶第五家族典型的（β/α）8形式TIM桶状结构;与中温和低温结构同源物比较,FnCel5A在氨基酸组成和分子内相互作用等方面具备高稳定性酶的结构特征;确定了Glu283-His126和Glu167-His226双催化活性中心,以及底物结合残基;结合分子模拟,提出了FnCel5A与底物结合的模型,阐明了该酶水解直链糖底物的催化机理。论文第二部分克隆、表达、表征了来源于嗜热古菌的酰基肽水解酶N末端截短突变体ApAPH-ΔN21;结晶并利用分子置换法解析了2.5 ?分辨率的突变体结构。结构分析和性质测定结果显示,ApAPH-ΔN21较野生型的最适反应温度降低18℃,对热和化学变性剂抗性降低;平均结构B因子由野生型的19.4 ?2升高到突变体的28.4 ?2。以上证据表明保守的N末端的对于保持ApAPH或家族中其他成员的稳定性具有重要作用。

论文目录

• 提要
• 第一部分
• 第1 章 前言
• 1.1 嗜热菌和嗜热酶
• 1.1.1 嗜热酶的结构特征
• 1.1.2 嗜热酶的应用
• 1.2 纤维素酶和纤维素
• 1.2.1 纤维素酶的分类和作用方式
• 1.2.2 纤维素降解过程及其催化机理
• 1.2.3 纤维素酶分子结构
• 1.2.4 嗜热纤维素酶的来源及在异源生物中的表达
• 1.2.5 嗜热纤维素酶的应用
• 1.3 论文立题依据
• 1.4 论文研究方法
• 1.5 论文结构安排
• 第2 章 蛋白质晶体的制备
• 2.1 嗜热β-1,4-葡聚糖内切酶FnCel5A的生物信息学分析
• 2.1.1 嗜热β-1,4-葡聚糖内切酶FnCel5A的一级序列分析
• 2.1.2 FnCel5A催化结构域及其N末端截短突变体蛋白质信息
• 2.1.3 FnCel5A的进化关系与同源比对分析
• 2.1.4 FnCel5A的同源结构搜索
• 2.2 FnCel5A及其N末端截短突变体FnCel5AND的克隆、表达和纯化
• 2.2.1 FnCel5A和FnCel5AND的克隆
• 2.2.2 FnCel5A和FnCel5AND的表达
• 2.2.3 FnCel5A和FnCel5AND的纯化
• 2.3 FnCel5A及截短突变体FnCel5AND的结晶
• 2.3.1 FnCel5A及截短突变体结晶条件的初步筛选
• 2.3.2 NHFnCel5A和FnCel5AND结晶条件的优化
• 2.3.3 NHFnCel5A硒代甲硫氨酸衍生物晶体的制备
• 2.3.4 FnCel5AND与底物纤维二糖的共结晶
• 第3 章 数据收集与晶体结构解析
• 3.1 X射线衍射数据收集与数据处理
• 3.1.1 NHFnCel5A母体晶体衍射数据的收集与处理
• 3.1.2 NHFnCel5A硒代甲硫氨酸衍生物晶体衍射数据的收集与处理
• 3.1.3 FnCel5AND:Glucose复合物晶体衍射数据的收集与处理
• 3.2 单波长反常散射法（SAD）解析NHFnCel5A硒代衍生物的晶体结构
• 3.2.1 X射线衍射分析的基本原理和相位问题
• 3.2.2 求解相位问题的方法
• 3.2.3 确定并修正硒原子的位置
• 3.2.4 初始相位的获得
• 3.2.5 相位改善和密度修正
• 3.2.6 结构模型的搭建与精修
• 3.2.7 最终结构模型的质量评估
• 3.3 分子置换解析FnCel5A母体和FnCel5AND:Glucose复合物晶体结构
• 3.3.1 分子置换法的原理
• 3.3.2 结构模型的建立和相位的求解
• 3.3.3 FnCel5A母体和FnCel5AND:Glucose复合物结构模型的精修
• 3.3.4 FnCel5A和FnCel5AND:Glucose复合物最终结构模型的质量评估
• 第4 章 晶体结构分析与讨论
• 4.1 嗜热β-1,4-葡聚糖内切酶FnCel5A活性结构域的整体结构
• 4.1.1 FnCel5A活性结构域整体结构描述
• 4.1.2 FnCel5A与同源结构间的比较
• 4.1.3 FnCel5A结构稳定性因素
• 4.2 FnCel5A的催化活性中心
• 4.2.1 FnCel5AND:Glucose复合物的晶体结构
• 4.2.2 FnCel5A的活性中心
• 4.2.3 活性中心水分子对底物结合及催化反应发生的贡献
• 4.2.4 FnCel5A活性中心磷酸根离子的结合
• 4.3 FnCel5A的催化机理
• 第5 章 结论与展望
• 参考文献
• 第二部分
• 第1 章 前言
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 脯氨酸寡肽酶家族
• 1.2.2 酰基肽水解酶研究现状
• 第2 章 突变体克隆、表达、纯化与晶体制备
• 2.1 突变体的克隆
• 2.2 突变体的表达、纯化
• 2.3 突变体ApAPH-ΔN21 的结晶
• 第3 章 数据收集和结构解析
• 3.1 突变体ApAPH-ΔN21 的数据收集与处理
• 3.2 突变体ApAPH-ΔN21 的结构解析和修正
• 3.3 突变体ApAPH-ΔN21 最终结构模型的质量评价
• 第4 章 酶的性质测定
• 4.1 温度对野生型和突变体催化活性的影响
• 4.2 野生型和突变体酶的热失活动力学研究
• 4.3 野生型和突变体酶热变性过程的热力学研究
• 4.4 化学变性剂对稳定性的影响
• 4.5 突变体柔性分析
• 第5 章 晶体结构分析与讨论
• 5.1 嗜热酰基肽水解酶突变体ApAPH-ΔN21 的整体结构
• 5.2 嗜热酰基肽水解酶N末端对酶热稳定性和活性的影响
• 5.2.1 嗜热酰基肽水解酶N末端螺旋对于酶的稳定性有重要作用
• 5.2.2 N末端盐桥对酶的稳定性的影响
• 5.2.3 N末端对酶构象柔性和催化活性的影响
• 第6 章 结论与展望
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 创新点
• 作者简历
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract