Wnt/β-catenin通路在胰腺癌的表达及干扰CXCR4基因对其抑制作用的体外实验研究

论文摘要

目的:胰腺癌恶性度高,发病率逐年上升。据报道,80%的胰腺癌患者由于转移的发生失去手术机会。Wnt/β-catenin通路在消化道肿瘤进展中具有重要作用。此外,肿瘤转移的趋向性学说以及趋化因子受体CXCR4的作用备受关注。据此,设计该实验,旨在1.明确Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌细胞中的活性,以及Wnt/β-catenin通路靶基因在胰腺癌细胞中的表达;2.观察Wnt拮抗剂DKK-1和sFRPs因子在胰腺癌中的表达,探讨Wnt拮抗剂表遗传学改变对胰腺癌Wnt/β-catenin通路的作用机制;3.观察胰腺癌组织中CXCR4的表达变化以及与临床病理特征之间的关系;4.观察胰腺癌组织中β-catenin的表达变化,探讨其与CXCR4的相互关系;5.利用RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,观察Wnt/β-catenin通路活性及靶基因的变化,验证CXCR4调控Wnt/β-catenin通路抑制胰腺癌的假设;6.观察CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖、细胞周期以及侵袭能力的变化。方法:1.通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察Wnt/β-catenin通路在胰腺癌细胞中的活性,应用Real-time PCR技术检测Wnt通路下游靶基因及Wnt拮抗剂DKK-1和sFRPs mRNA水平的表达,观察Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌细胞中的变化;2.通过MSP方法和5-氮杂-脱氧胞苷酸处理分析Wnt拮抗剂sFRPs、DKK-1在胰腺癌细胞中的甲基化,并应用基因重组技术双向调节DKK-1在不同胰腺癌细胞中的表达,观察Wnt通路活性的变化,分析Wnt拮抗剂的甲基化对Wnt通路的调节作用;3.通过免疫组化分析CXCR4、β-catenin在胰腺癌组织中的表达,以及与临床病理特征之间的关系,探讨CXCR4与β-catenin的相关性;4.通过RNAi技术构建CXCR4 shRNA表达载体,转染胰腺癌CXCR4高表达细胞,通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察RNAi对CXCR4基因的抑制效率;5.通过PGL3-OT/OF荧光素酶检测方法观察CXCR4基因沉默后对胰腺癌Wnt/β-catenin经典通路活性的影响,并通过Realtime-PCR、Western Blot实验观察CXCR4 shRNA对Wnt/β-catenin通路下游靶基因以及侵袭转移相关蛋白的影响;6.通过MTT实验、流式细胞术、软琼脂克隆形成实验检测CXCR4基因干扰后胰腺癌细胞增殖、细胞周期以及细胞成瘤性的变化,并应用Transwell侵袭小室观察CXCR4干扰对胰腺癌细胞侵袭转移力的影响。结果:1.与正常胰腺细胞相比,多数胰腺癌细胞表现为Wnt/β-catenin通路的异常激活,此外,Wnt/β-catenin下游靶基因的mRNA水平也具有不同程度的升高,通过对β-catenin Exon 3的测序分析,未发现胰腺癌具有β-catenin Exon 3的突变;2. Wnt拮抗剂sFRPs和DKK-1因子在胰腺癌细胞中表达水平较低,MSP分析发现sFRPs和DKK-1启动子区在胰腺癌细胞中发生甲基化,5-氮杂-脱氧胞苷酸处理后能显著提高DKK-1和sFRP-1的表达（P<0.01）。当RNAi技术干扰DKK-1表达后,Wnt通路活性上升;当PCMV-XL5-DKK1转染细胞上调DKK-1表达时,Wnt通路活性下降（P<0.05）;3. CXCR4与β-catenin在胰腺癌组织中具有异常表达,两者之间有显著相关性（rs=0.443, P=0.002）。此外,CXCR4表达高的胰腺癌患者临床预后差;4.特异性CXCR4基因沉默能够在基因和蛋白水平稳定、高效、特异地抑制CXCR4的表达,抑制效率达70%以上,同时,磷酸化CXCR4蛋白表达水平也有明显的下降（P<0.05）;5.特异性CXCR4干扰后能够显著抑制PGL3-OT转染后的荧光素活性（P<0.05）以及Wnt/β-catenin靶基因的表达;6.特异性CXCR4 shRNA能够抑制细胞生长,细胞达到对数生长期的时间延长（P<0.05）,同时CXCR4基因沉默能够阻滞Miapaca-2细胞于G0/G1期,减少S期细胞的数目,抑制细胞的增殖能力。同时,软琼脂克隆形成实验发现CXCR4干扰后,细胞克隆数目显著减少（P<0.01）。Transwell实验证明CXCR4基因干扰后细胞侵袭能力减低（P<0.05）,即使SDF-1的刺激也不能够使细胞侵袭能力增加。结论:1.胰腺癌细胞中存在Wnt/β-catenin通路的异常激活。Wnt通路的激活与β-catenin Exon 3的突变无关;2.胰腺癌中Wnt拮抗剂发生表遗传学变化,启动子区的甲基化引起DKK-1表达沉默可能是胰腺癌Wnt通路异常激活的原因,DKK-1的表达与胰腺癌Wnt经典通路的活性呈负相关;3. CXCR4在胰腺癌中异常表达,与β-catenin表达显著相关,CXCR4表达高的胰腺癌患者临床预后差;4. CXCR4基因沉默能抑制Wnt/β-catenin经典通路在胰腺癌中的活性,阻遏Wnt/β-catenin通路下游靶基因表达,抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和成瘤能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号表
• 1 绪论
• 2 背景回顾
• 2.1 胰腺癌的生物治疗
• 2.1.1 免疫治疗
• 2.1.2 抗血管生成治疗
• 2.1.3 靶向治疗
• 2.2 Wnt 通路与肿瘤
• 2.2.1 Wnt 通路介绍
• 2.2.2 Wnt/β-catenin 经典通路
• 2.2.3 作用于Wnt 信号通路的拮抗剂及其作用机制
• 2.2.4 Wnt 通路和消化道肿瘤
• 2.2.5 Wnt/β-catenin 与靶向治疗
• 2.3 趋化因子CXCR4 受体与肿瘤进展
• 2.3.1 CXCR4 及其配体SDF-1 的结构和功能
• 2.3.2 SDF-1/CXCR4 轴的信号传导
• 2.3.3 SDF-1/CXCR4 与恶性肿瘤的生长、转移
• 2.3.4 CXCR4 与胰腺癌
• 2.3.5 CXCR4 及其配体在恶性肿瘤治疗中的作用
• 2.4 CXCR4 与Wnt/β-catenin 之间的关系
• 2.5 RNAi 在生物中的应用
• 3 Wnt/β-catenin 经典通路在胰腺癌中的体外作用研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 细胞培养
• 3.2.5 细胞总RNA 的提取及cDNA 合成
• 3.2.6 Realtime-PCR 检测细胞中基因的表达
• 3.2.7 β-catenin Exon3 突变的检测
• 3.2.8 MSP 检测各目的基因甲基化状态
• 3.2.9 5-氮杂-脱氧胞苷酸处理
• 3.2.10 荧光素酶报告基因检测Wnt 经典通路的异常活化
• 3.2.11 siRNA 转染
• 3.2.12 统计学方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 胰腺癌细胞中Wnt/β-catenin 通路活性的变化
• 3.3.2 胰腺癌细胞中Wnt/β-catenin 通路相关基因的表达
• 3.3.3 β-catenin Exon3 在胰腺癌细胞中的突变
• 3.3.4 Wnt 拮抗剂在胰腺癌中的表达
• 3.3.5 Wnt 拮抗剂在胰腺癌中的甲基化
• 3.3.6 5-氮杂-脱氧胞苷酸对胰腺癌细胞Wnt 拮抗剂的影响
• 3.3.7 调节DKK-1 的变化对胰腺癌Wnt 通路的变化
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 4 趋化因子受体CXCR4 在胰腺癌中的表达及与临床的关系
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 研究对象
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 主要液体的配制
• 4.2.5 免疫组织化学技术检测胰腺癌CXCR4、β-catenin 的表达
• 4.2.6 Real-Time PCR 反应观察CXCR4 mRNA 在胰腺癌细胞株中的表达
• 4.2.7 Western Blot 观察不同胰腺癌细胞株CXCR4 蛋白水平的表达
• 4.2.8 统计学方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 CXCR4 与β-catenin 在胰腺癌中的表达
• 4.3.2 CXCR4，β-catenin 表达与临床病理的关系
• 4.3.3 CXCR4，β-catenin 的表达对胰腺癌患者预后的影响
• 4.3.4 胰腺癌细胞中CXCR4 的表达
• 4.3.5 CXCR4 蛋白水平在胰腺癌细胞中的表达
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 5 干扰CXCR4 基因调控Wnt/β-catenin 通路在胰腺癌中作用的体外实验研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 主要液体的配制
• 5.2.5 CXCR4 shRNA 质粒构建
• 5.2.6 脂质体介导的pRNAT-U6.1/Neo-CXCR4 shRNA 转染Miapaca-2 细胞
• 5.2.7 RealTime-PCR 检测CXCR4 shRNA 对CXCR4 的抑制作用
• 5.2.8 Western Blot 检测CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞CXCR4 的抑制作用
• 5.2.9 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 Wnt 通路的影响
• 5.2.10 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞的生物学效应
• 5.2.11 统计方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 CXCR4 mRNA 序列的获得和siRNA 序列的设计
• 5.3.2 siRNA 表达载体的构建与鉴定
• 5.3.3 CXCR4 shRNA 转染Miapaca-2 细胞
• 5.3.4 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞CXCR4 mRNA 表达的抑制作用
• 5.3.5 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞CXCR4 蛋白表达的抑制作用
• 5.3.6 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞Wnt 活性的影响
• 5.3.7 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞Wnt 特异基因的作用影响
• 5.3.8 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞细胞增殖的影响
• 5.3.9 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞细胞周期的影响
• 5.3.10 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞克隆的影响
• 5.3.11 特异性CXCR4 shRNA 对Miapaca-2 细胞侵袭力的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 结论
• 6 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间取得的研究成果