猪瘟兔化弱毒标记株感染性克隆的构建与病毒拯救

论文摘要

猪瘟（Classic Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classic Swine Fever virus,CSFV）引起的一种猪的高度接触性传染疾病,被世界动物卫生组织（Office International des Epizoofies,OIE）列为必须通报传染病之一。猪瘟的流行给世界养猪业的发展和贸易造成了巨大损失。猪瘟兔化弱毒疫苗（hog cholera lapinized virus.HCLV）从1957年就在国内广泛应用于猪瘟的预防（Zhou TC,1980）。不仅为我国,而且还为欧洲国家CSF控制作出了重大贡献,是世界公认的金标准弱毒疫苗。但由于疫苗接种猪与自然感染猪不能从血清学上予以区分,不利于猪瘟的净化和消灭,研制标记疫苗有助于解决这个问题。本研究运用反向遗传操作技术,在实验室已构建的C株感染性克隆的基础上,在E1的C末端插入FLAG基因作为标记分子,构建含有FLAG基因的猪瘟兔化弱毒标记毒株v C-FLAG的感染性克隆,并成功拯救出含有FLAG标记的v C-FLAG病毒,并采用猪瘟E2单克隆抗体WH303,FLAG单克隆抗体免疫组化染色,RT-PCR、荧光定量PCR等方法鉴定拯救病毒为v C-FLAG病毒。通过病毒的细胞适应性实验,证明v C-FLAG病毒可以适应多种猪源细胞,其中以SK6细胞为最佳。通过常规病毒传代、细胞带毒传代以及带毒细胞混合正常细胞培养等方法研究标记病毒的传代方式,使用猪瘟病毒抗原检测ELISA以及传代病毒滴度测定,探索病毒增殖的最佳条件。证明了SK6细胞系是培养v C-FLAG的最适细胞系,探索出了使用带毒细胞混合正常细胞进行传毒的病毒传代方法。不同代次病毒经免疫组化、RT-PCR和核苷酸序列测定证明嵌合病毒能稳定表达标记抗原,且在细胞中传代的遗传稳定性良好。通过兔体实验,研究了猪瘟兔化弱毒标记毒株与兔体反应热的关系,以及兔猪瘟抗体的消长情况。v C-FLAG保持了与C株兔组织毒一样的能够引起典型的兔体反应热的特性。并且两株病毒引起的兔血清猪瘟抗体增长规律一致。v C-FLAG在兔体上连续传四代,经RT-PCR测序证明该毒株在兔体上的遗传稳定性良好。为探索研究FLAG抗体的检测方法,分别采用FLAG的合成肽,FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反应板,首先使用FLAG单克隆抗体建立间接ELISA检测方法。比较发现FLAG-BAP蛋白包被的ELISA反应板更加灵敏。于是采用FLAG-BAP包被ELISA反应板进行兔血清抗体的检测,在接种v C-FLAG和C株第21天的兔血清中FLAG抗体水平并没有太大的差别。随后使用商品化兔抗FLAG多克隆抗体进行验证,发现该方法对于检测兔抗FLAG抗体并没有明显的特异性。实验结果表明,标记抗体检测方法尚不成熟,但为进一步研究标记抗体检测方法提供了重要数据。综合上述结果表明,v C-FLAG标记嵌合毒株,可以很好的展示FLAG抗原肽,并且可采取感染细胞混合正常细胞培养的方式进行大量繁殖,在细胞和兔体上传代遗传稳定。v C-FLAG保持着C株在兔体上引起典型兔体反应热的特点,且能够诱导兔子产生猪瘟抗体。初步探索了标记抗体检测方法,为进一步完善标记疫苗配套检测方法提供了重要数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 插图及附表清单
• 缩略语中英文对照表
• 第一章 概述
• 1.1 猪瘟概述
• 1.2 猪瘟病毒分类及其基因组结构
• 1.2.1 核衣壳蛋白C
• 1.2.2 结构蛋白Erns（E0）
• 1.2.3 结构蛋白E1
• 1.2.4 结构蛋白E2
• 1.2.5 P7
• 1.2.6 NS2-3 蛋白
• 1.2.7 NS4
• 1.2.8 NS5
• 1.3 猪瘟病毒的增殖及细胞培养
• 1.4 猪瘟疫苗研究进展
• 1.4.1 常规疫苗
• 1.4.2 标记疫苗及血清学检测方法
• 1.4.3 重组嵌合疫苗
• 1.4.4 DNA疫苗
• 1.4.5 亚单位疫苗
• 1.4.6 多肽疫苗
• 1.4.7 结论
• 第二章 前言
• 2.1 研究目的和研究意义
• 2.2 研究内容和技术路线
• 2.2.1 E1插入片段的生物信息学分析
• 2.2.2 含有FLAG短肽基因的嵌合病毒vC-FLAG感染性克隆的构建
• 2.2.3 标记病毒与兔体反应之间的关系
• 2.2.4 标记病毒在兔体上的传代
• 2.2.5 FLAG抗体检测方法的建立
• 2.3 技术路线
• 2.3.1 本研究的主要技术路线
• 2.3.2 含有FLAG基因的猪瘟兔化弱毒疫苗株全长构建思路
• 2.3.3 FLAG标记的猪瘟兔化弱毒疫苗毒株的感染性克隆的构建策略
• 第三章 E1转座子二级结构分析及阳性标记分子的设计
• 3.1 序列和方法
• 3.1.1 RB-C22v转座子氨基酸序列
• 3.1.2 方法
• 3.2 转座子分析结果
• 3.2.1 Pepinfo分析结果
• 3.2.2 Garnier分析结果
• 3.2.3 Tmap分析结果
• 3.2.4 结论
• 3.3 设计标记片段
• 3.3.1 Pepinfo分析结果
• 3.3.2 Garnier分析结果
• 3.3.3 Tmap分析结果
• 3.3.4 结论
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建与拯救
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 pC-FLAG Bam-Bsp酶切鉴定
• 4.2.2 多对酶切鉴定pC-FLAG全长质粒
• 4.2.3 PCR鉴定pC-FLAG全长质粒
• 4.2.4 将PCR结果送去测序
• 4.2.5 FLAG标记的CSFV兔化弱毒株全基因组c DNA克隆的线性化
• 4.2.6 FLAG标记的CSFV兔化弱毒嵌合病毒全基因组CDNA克隆的体外转录
• 4.2.7 BHK电转染FLAG标记的CSFV兔化弱毒株嵌合病毒感染性病毒粒子的拯救
• 4.2.8 SK6电转染FLAG标记的CSFV兔化弱毒株嵌合病毒感染性病毒粒子的拯救
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 VC-FLAG病毒传代方法研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 vC-FLAG病毒的常规传代结果
• 5.2.2 vC-FLAG不同细胞的适应性实验结果
• 5.2.3 vC-FLAG病毒的带毒传代免疫组化染色结果
• 5.2.4 vC-FLAG细胞毒上清RT-PCR结果
• 5.2.5 vC-FLAG带毒传代不同代次细胞上清接种SK6细胞实验结果
• 5.2.6 vC-FLAG带毒传代不同代次细胞上清ELISA检测结果
• 5.2.7 vC-FLAG带毒传代不同代次细胞上清TCID50的测定结果
• 5.2.8 vC-FLAG带毒细胞混合正常SK6细胞培养条件免疫组化鉴定结果
• 5.2.9 vC-FLAG带毒细胞混合正常SK6细胞培养上清病毒荧光定量PCR检测
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 猪瘟兔化弱毒疫苗FLAG标记毒株与兔体反应热
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 测定C株兔组织毒病毒含量
• 6.1.2 兔体接种
• 6.1.3 病毒兔体接种体温测定
• 6.1.4 vC-FLAG兔体传代实验
• 6.1.5 兔脾毒的RT-PCR鉴定
• 6.1.6 vC-FLAG兔脾毒兔体反应热单位的测定
• 6.1.7 兔血清猪瘟抗体测定
• 6.2 结果
• 6.2.1 病毒兔体接种体温测定结果
• 6.2.2 兔脾毒的RT-PCR鉴定
• 6.2.3 vC-FLAG兔脾毒兔体反应热单位的测定结果
• 6.2.4 兔血清猪瘟抗体检测结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 FLAG抗体检测方法的建立
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 FLAG合成肽包被ELISA反应板FLAG抗体检测方法的建立
• 7.1.3 FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反应板FLAG抗体检测方法的建立
• 7.1.4 FLAG合成肽与FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反应板检测方法的比较
• 7.1.5 兔血清FLAG抗体的测定
• 7.1.6 使用兔抗FLAG多抗进行检测方法的验证
• 7.2 结果
• 7.2.1 FLAG合成肽包被ELISA反应板FLAG抗体检测结果
• 7.2.2 FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反应板FLAG抗体检测结果
• 7.2.3 FLAG合成肽与FLAG-BAP融合蛋白包被ELISA反应板FLAG抗体检测比较结果
• 7.2.4 兔血清FLAG抗体的测定
• 7.2.5 使用兔抗FLAG多抗进行检测方法的验证
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 进一步工作的方向
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历