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戊型肝炎病毒中和表位研究

2020-11-23阅读(975)

戊型肝炎病毒中和表位研究

论文摘要

戊型肝炎是发展中国家的一种主要的急性肠道传染病。其在孕妇感染者的病死率却可高达20%,尤其是后3个月的妊娠晚期者最高可达56%。1986~1988年间我国新疆南部的HEV大流行造成了12万人发病,千余人死亡。目前,越来越多的证据表明戊型肝炎是一种人畜共患病。其危害日益被人们所重视。但由于至今尚未建立有效的HEV细胞培养模型或简便的病毒繁殖模型,国内外学者对戊型肝炎病毒的发病、致病机理和疫苗的研究都相对缓慢。HEV是一种无包膜二十面体对称结构RNA病毒,其主要免疫表位集中在病毒衣壳,由ORF2编码的单一蛋白。在大肠杆菌中表达的ORF2的一个片段(NE2)可以自发形成以二聚体为基础的多种聚合结构,二聚体蛋白与病人血清的反应性显著强于单体蛋白,提示二聚体蛋白形成了HEV的重要免疫优势表位。NE2蛋白免疫恒河猴可以对HEV产生完全的保护性。本研究用分析超离技术测得NE2蛋白在溶液中主要形式的沉降系数为2.65S,分子量为46kDa,摩擦比为1.69,提示为中度不对称性的二聚体形式。基于上述研究结果,本研究用NE2抗原制备了多株单克隆抗体,其中6株对二聚体的反应性强于单体,提示识别构象型表位;2株对二聚体、单体及变性蛋白的反应性相当,提示识别线性表位。进一步,我们通过体在体外用MAb进行HEV的免疫捕获PCR,证实MAb 8C11、13D8和8H3能够直接捕获病毒,提示它们识别病毒颗粒表面的暴露结构。通过ELISA及生物传感器验证这三株MAb的交叉阻断实验发现,8C11和13D8可以相互完全阻断,提示识别同一表位区域,而13D8对8H3不能阻断,8C11非但不能阻断8H3,而且对8H3的结合有显著增强作用。利用Biacore生物传感器测定这3株MAb及其Fab的亲和常数(KD),8C11和13D8的KD值均为20nmol/L左右,其Fab片段的KD值较完整抗体有数十倍的提高,可解释为完整抗体的二价效应;MAb 8H3的KD值为1 000nmol/L左右,但其Fab的KD值降低了105,提示Fab可以更容易地接近抗原表位并与之结合,意味着E2抗原上的8H3表位被其他结构所部分遮盖,而8C11与抗原的结合可能引起了抗原空间结构的改变,从而去除了对8H3表位的遮盖,导致8H3与抗

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 缩略词
  • 前言
  • 1. 戊型肝炎病毒及其衣壳蛋白表位、抗体的研究进展
  • 1.1 戊型肝炎
  • 1.2 戊型肝炎病毒的生物学特性
  • 2. 抗体与抗原的相互作用
  • 2.1 抗体及其空间结构
  • 2.2 抗体与抗原的相互作用
  • 3. 噬菌体展示系统
  • 3.1 噬菌体展示系统基本原理及应用
  • 3.2 噬菌体展示肽库及其应用
  • 4. 本论文研究的思路、目的和意义
  • 材料与方法
  • 1. 材料
  • 1.1 主要仪器
  • 1.2 主要试剂与材料
  • 1.3 常用溶液及培养基配制
  • 2. 方法
  • 2.1 基因克隆
  • 2.2 重组蛋白的表达与纯化
  • 2.3 重组蛋白性质的分析方法
  • 2.4 细胞实验
  • 2.5 杂交瘤融合制备MAb
  • 2.6. MAb性质鉴定
  • 2.7 木瓜蛋白酶制备MAb Fab片段
  • 2.8 恒河猴感染实验
  • 2.9 噬菌体随机7 肽库的操作
  • 2.10 生物传感器相关操作
  • 2.11 分析型超速离心机相关操作
  • 2.12 计算机辅助分析与设计
  • 结果与分析
  • 第一部分 抗HEV ORF2 MAb及其Fab片段的制备
  • 1. MAb的筛选
  • 2. MAb Fab片段的制备及纯化
  • 第二部分 HEV中和表位的鉴定及表位特征研究
  • 1. HEV MAb识别表位在NE2 蛋白上的空间位置关系
  • 2. HEV 病毒外表面表位的鉴定
  • 3. MAb 8C11 和8H3 的中和活性
  • 4. 中和表位8C11 和8H3 也是HEV的免疫优势表位
  • 5. HEV衣壳蛋白上8C11 表位的结合引发8H3 表位的构象变化
  • 6. 8C11、8H3 中和表位的形成区域
  • 7. 溶液中中和MAb与NE2 蛋白相互作用的AU技术分析
  • 第三部分 HEV ORF2 中和表位模拟肽初步研究
  • 1. 表位模拟肽的筛选及序列特征
  • 2. MAb 8H3 筛选到的模拟7 肽的合成及结合活性检测
  • 3. 表位模拟肽的克隆表达及活性鉴定
  • 讨论
  • 1. HEV衣壳蛋白的表位特征
  • 2. HEV免疫优势中和表位区域
  • 3. HEV两个中和表位与病毒感染机制的关系
  • 4. HEV衣壳蛋白中和表位间的构象诱导
  • 5. HEV感染的免疫学诊断
  • 6. HEV疫苗的质控
  • 7. HEV中和表位模拟肽的筛选
  • 8. 抗体片段的生物学意义
  • 9. AU技术分析HEV中和MAb与NE2 蛋白的相互作用
  • 小结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 一、 在校期间发表论文
  • 二、 在校期间获得奖励

    • 相关论文文献

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