水稻细胞周期关键调节基因的全基因组分析及Orysa；DEL1功能的初步鉴定

论文摘要

细胞分裂是生物体中一个重要的生物学过程。真核生物细胞周期进程调控的分子机制是高度保守的。在真核生物中已经鉴定出细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）、细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDK inhibitors, CKIs）、成视网膜细胞瘤蛋白（retinoblastomas, Rbs）和E2F、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶亚单位（CDK subunits, CKSs）等多种细胞周期关键调节因子。其中,CDKs在细胞周期调控过程中起到非常重要的作用。高等植物中,在时间和空间上调控细胞分裂的进行对植物体的形态建成是必需的。而植物激素在调控细胞周期过程中起到重要的作用。迄今对双子叶植物细胞周期调节基因的研究较多,但有关单子叶植物水稻中的报道很少。水稻不仅是一种重要的模式植物,也是重要的粮食作物。因此,我们对水稻细胞周期关键调节基因进行了鉴定和表达分析。研究结果为阐明水稻细胞周期的分子机理及其发育调控提供了有重要价值的基础资料。根据拟南芥基因组信息,利用BLAST软件从水稻基因组中检索到90个细胞周期相关基因的序列,其中44个基因编码细胞周期蛋白,25个基因编码细胞周期蛋白依赖性激酶,7个基因编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,9个基因编码E2F蛋白,2个RB蛋白基因,2个WEE激酶基因和1个CKS基因。在检索到的90个基因中新命名的或着是对其原有的命名进行更正的有41个基因。通过对水稻细胞周期关键调节基因的系统进化树和蛋白质结构分析发现,在水稻和拟南芥中细胞周期关键调节基因之间是非常保守的。为了研究片段重复与新的细胞周期关键基因的产生之间的关系,我们绘制了水稻中CDK、E2F、CKI、CKS、Rb和Wee的不同成员在染色体上的排列分布图。结果表明在水稻的12条染色体的九条之间发生了七次片段重复事件,并且大部分的重复发生在2、3、10和12号染色体上。染色体片段的重复是产生新基因的基础,某些基因家族中不同成员的产生是基因组中发生片断重复的结果。基因表达模式能够为研究基因的功能提供重要线索,我们通过半定量RT-PCR方法初步研究了水稻中细胞周期关键基因的表达模式。结果表明水稻细胞周期关键调节基因之间具有不同的表达模式,大部分细胞周期基因在被检测的多数组织中均有表达,而某些基因的表达具有一定的组织特异性。同一基因家族成员之间呈现出相似的表达模式,不同基因家族之间的表达模式差异较大。基因的表达模式和系统进化树分析结果暗示,同一家族的成员之间可能存在着功能上的冗余。为准确地了解水稻细胞周期关键基因的表达模式,随机选取Orysa;CycA2;1、Orysa;CycB2;2、Orysa;CycU4;4与Orysa;CDKG;1四个基因进行了原位杂交分析。原位杂交结果与RT-PCR结果吻合,同时也发现水稻中细胞周期关键调节基因的表达在时空上受到了调控,并具有较强的组织器官特异性,基因的表达还呈现出细胞周期依赖的特征。为了研究激素对水稻细胞周期关键基因的调节,分别用10μM IAA和5μM 6-BA处理萌发后10天的水稻幼苗,进行半定量RT-PCR分析。结果表明,25个细胞周期关键调节基因的表达量受到IAA明显上调,4个基因的表达量受IAA明显下调,11个基因的表达受6-BA上调,26个基因的表达受6-BA下调。在整个细胞周期进程中,生长素和细胞分裂素单独或着同时调节了某些细胞周期基因的表达。为进一步研究细胞周期关键调节基因在水稻发育过程中的作用,选择Orysa;DEL1基因进行了较为详细的分析。该基因编码441个氨基酸残基。序列比对和系统进化树分析结果表明,Orysa;DEL1基因所编码的氨基酸与其他植物中的E2Fe/DEL1基因所编码的氨基酸序列同源性较高,含有两个保守的DNA结合区,在每个结合区内均包含一个高度保守的DNA识别基序（RRxYD）。尽管在Orysa;DEL1中没有预测到核定位信号,亚细胞定位结果表明该蛋白定位在细胞核内。RT-PCR结果显示,除在胚乳发育晚期外,在大部分组织和器官中都检测到了该基因的表达,在营养器官的根、幼叶、成熟叶片和节中表达量较高,在种子发育过程中主要在种子发育早期表达和胚中表达。原位杂交结果显示该基因在根、幼叶和胚中均有表达。分别构建Orysa;DEL1基因的正义和RNAi的表达载体进行水稻的遗传转化,研究该基因的功能。利用扫描电镜观察过量表达Orysa;DEL1的转基因植株叶片,发现近轴面的表皮毛大量缺失,在转基因植株颖壳上表皮毛亦明显减少。且表型变化的轻重与该基因表达量的提高是一致的。综上所述,本研究通过比较水稻和拟南芥中细胞周期关键调节基因发现,在两个物种中均由多个庞大而复杂的基因家族组成,虽然两个物种之间在某些家族和某一类型上发生了一定的改变,但是细胞周期基因的种类和数目上是相对保守的。水稻和拟南芥中细胞周期基因同源关系的比较也是进行功能比较的基础。此外,对Orysa;DEL1基因功能分析表明,它在水稻的表皮毛的起始或发育过程中起到非常重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 控制细胞周期的原理
• 1.2 细胞周期的主要调节因子
• 1.2.1 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase, CDK）
• 1.2.2 细胞周期蛋白（cyclin）
• 1.2.3 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂（CDK inhibitor, CKI）
• 1.2.4 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶亚单位（CDK subunit, CKS）
• 1.2.5 成视网膜瘤蛋白（Retinoblastoma, Rb）
• 1.2.6 E2F 转录因子
• 1.3 细胞周期的转换
• 1→S 的转换'>1.3.1 G₁→S 的转换
• 1.3.1.1 Rb 蛋白的磷酸化调控细胞进入S 期
• 1/S 的转换'>1.3.1.2 E2F/DP 调控G₁/S 的转换
• 2→M 的转换'>1.3.2 G₂→M 的转换
• 1.3.3 核内再复制（endoreduplication）
• 1.4 激素调控细胞周期
• 1.4.1 生长素对细胞周期的调控
• 1.4.2 细胞分裂素对细胞周期的调控
• 1.4.3 其他激素对细胞周期的调控
• 1.5 细胞周期与生长发育
• 1.5.1 细胞周期的进入
• 1.5.2 细胞周期的退出
• 1.5.2.1 细胞周期的退出和细胞的分化
• 1.5.2.2 细胞周期的退出和环境的胁迫
• 1.5.3 控制DNA 完整性的检查点
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻材料
• 2.1.2 菌株和质粒载体
• 2.1.3 酶、试剂盒、培养基、杂交膜、各种化学药品及仪器
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 序列数据的获取
• 2.2.2 进化树分析
• 2.2.3 蛋白质的亚细胞定位预测
• 2.2.4 植物基因组DNA 的提取、纯化
• 2.2.4.1 植物基因组DNA 的提取
• 2.2.4.2 植物基因组DNA 的纯化
• 2.2.5 植物组织总RNA 的提取、cDNA 的制备
• 2.2.5.1 植物总RNA 的提取
• 2.2.5.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.6 PCR 的扩增及半定量RT-PCR
• 2.2.6.1 PCR 扩增
• 2.2.6.2 细胞周期基因在不同器官中的表达分析
• 2.2.6.3 生长素和细胞分裂素调节细胞周期基因表达的分析
• 2.2.6.4 转基因水稻的半定量RT-PCR 分析
• 2.2.7 目的基因的分离
• 2.2.7.1 目的基因的PCR 扩增
• 2.2.7.2 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.7.3 序列测定
• 2.2.8 表达载体的构建
• 2.2.8.1 Orysa;DEL 基因正义表达载体的构建
• 2.2.8.2 RNAi 表达载体的构建
• 2.2.8.3 GFP 融合表达载体的构建
• 2.2.9 Northern 杂交分析
• 2.2.9.1 总RNA 的提取
• 2.2.9.2 甲醛变性胶电泳
• 2.2.9.3 转膜
• 2.2.9.4 预杂交
• 2.2.9.5 探针的制备
• 2.2.10 RNA 原位杂交
• 2.2.10.1 材料的固定
• 2.2.10.2 材料的包埋
• 2.2.10.3 切片
• 2.2.10.4 正义和反义探针的制备
• 2.2.10.5 脱蜡、消化、乙酰化、杂交
• 2.2.10.6 洗片
• 2.2.10.7 检测
• 2.2.11 蛋白的亚细胞定位
• 2.2.11.1 材料准备
• 2.2.11.2 金粉准备
• 2.2.11.3 DNA 包裹金粉微粒
• 2.2.11.4 轰击操作
• 2.2.12 农杆菌介导的水稻转化
• 2.2.12.1 根癌农杆菌EHA105 感受态细胞的制备
• 2.2.12.2 电转法转化农杆菌
• 2.2.12.3 水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2.2.12.4 水稻愈伤组织的转化
• 2.2.13 转基因水稻的组织化学鉴定
• 2.2.14 扫描电镜观察
• 2.8.15 共聚焦显微镜观察
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻细胞周期关键调节基因的获得
• 3.1.1 细胞周期蛋白家族
• 3.1.2 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶家族
• 3.1.3 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂家族
• 3.1.4 E2F/DP 和Rb
• 3.1.5 CKS 和Wee
• 3.2 水稻细胞周期关键基因的基因组定位
• 3.3 水稻细胞周期关键基因的表达分析
• 3.3.1 水稻细胞周期关键基因的半定量RT-PCR 分析
• 3.3.2 水稻细胞周期基因的Northern 表达分析
• 3.3.3 水稻细胞周期关键基因的原位表达分析
• 3.3.4 水稻细胞周期关键基因表达对激素的响应
• 3.3.4.1 水稻细胞周期关键基因对生长素的响应
• 3.3.4.2 水稻细胞周期关键基因对细胞分裂素的响应
• 3.4
• 3.4.1 Orysa DEL1 基因的分离
• 3.4.2 Orysa;DEL1 基因的核苷酸序列分析以及推导的氨基酸序列
• 3.4.3 Orysa;DEL1 蛋白的亚细胞定位
• 3.4.4 Orysa;DEL1 基因时空表达模式分析
• 3.4.5 Orysa;DEL1 基因在水稻中的遗传转化
• 3.4.5.1 正义和RNAi 表达载体的构建
• 3.4.5.2 转基因植株的鉴定
• 3.4.6 Orysa;DEL1 基因的过量表达影响转基因水稻的发育
• 4 讨论
• 4.1 细胞周期关键基因的数目
• 4.2 细胞周期关键基因的结构与功能
• 4.3 细胞周期关键基因的表达
• 4.4 植物激素与细胞分裂
• 4.5 染色体片断重复与新基因的产生
• 4.6 Orysa;DEL1 基因的作用机制
• 5 结论
• 参考文献
• 附录一
• 攻读学位期间发表论文
• 致谢