论文摘要
乙型肝炎是一种在全球范围内流行的肝脏疾病,尤其在发展中国家。尽管目前HBV感染机制的研究得到较大的发展,但其成果主要集中在HBV感染与免疫系统的关系上,而HBV感染对宿主细胞的影响目前尚不清楚。越来越多的证据表明,HBV病毒对于肝细胞蛋白的表达具有调节作用,不同的病毒蛋白组合将产生不同的影响。另一方面,由HBV诱导的差异变化蛋白还可能打破机体的免疫耐受,使机体产生免疫识别而形成自身抗体。本研究旨在进一步探讨HBV病毒对肝细胞蛋白质谱表达的影响,并比较不同HBV蛋白存在状态下肝细胞蛋白质组学变化的联系和差异。同时利用双向电泳和免疫印迹技术鉴定HBV转基因小鼠和HBV病人血清中针对肝细胞蛋白的自身反应性抗体。首先我们原代分离并比较了含有HBV全基因的HBV-Tg小鼠和对照小鼠肝细胞蛋白质谱的差异。共有27个差异表达的蛋白被鉴定出,包括17个表达上调的蛋白和10个表达下调的蛋白。生物信息学分析得出,其中13个蛋白为参与代谢、三羧酸循环和氧化应激的线粒体蛋白,表明肝细胞线粒体功能和氧化应激受到影响。4个蛋白（SELENBP,SCP2,RGN和PRDX1）表达的差异在HBV慢性感染病人标本中得到了确认。结果还表明,HBV转基因小鼠肝脏中参与氧化应激的重要基因（gpx、sod、ogg等）显著上调。同时,在HBV转基因小鼠肝脏线粒体中反应性氧自由基产生明显升高而ATP的产量显著下调。进一步的实验表明,HBV转基因小鼠肝细胞对于过氧化氢的毒性作用更加敏感。本研究还比较了不同HBV蛋白存在状态下肝细胞蛋白质组学变化的异同。首先将HBs-Tg这种部分HBV基因转入的小鼠与其对照小鼠肝细胞进行蛋白质组学比较。质谱鉴定结果表明,共有20个蛋白发生变化,其中上调的蛋白16种,下调的蛋白4种。综合分析HBV全基因转入小鼠和部分基因转入小鼠蛋白质变化谱,发现在部分HBV基因转入的小鼠中鉴定出所有20种差异蛋白中有16个蛋白的变化与HBV转基因小鼠相吻合。双向电泳-免疫印迹技术发现HBV-Tg小鼠和HBs-Tg小鼠血清中均存在自身抗体,在HBV-Tg小鼠血清中鉴定出8种自身抗体,其中有两种（Etfa和Dmgdh）是质谱鉴定出的在HBV转基因鼠中过表达的蛋白。我们进一步利用GO分析研究了这些自身反应蛋白在细胞中的定位,发现8种蛋白中的7种定位于肝细胞的线粒体中。而HBs转基因小鼠血清中鉴定出4种,其中3种与HBV转基因小鼠相吻合。推广至临床样本中我们同样发现HBV感染病人血清中存在自身抗体并成功鉴定出9种,其中3种（ECSH1、ALB和GLUD）与小鼠模型相一致,而抗-GLUD抗体更是在大规模样本实验中出现了较高的频率（5/30）成为潜在的HBV临床诊断治疗的靶点和标志。综上所述,本研究首次对比了HBV基因转入的哺乳动物肝细胞与野生型肝细胞的蛋白质组差异,并进一步的验证了生物信息学的分析结果。同时进行了HBV转基因小鼠以及HBV病人的血清组学分析,为了解HBV病毒对细胞蛋白表达的影响和机体对这些影响的反应提供了很好的理论基础。