家蚕翅模式决定基因的克隆、表达及功能研究

论文摘要

昆虫是地球上最早在空中飞行的动物。也是目前地球上种类最多、分布最广的一类生物。翅的发生使昆虫在觅食、寻偶、扩大分布和避敌等多方面获得了优越的竞争能力,是昆虫纲成为最繁荣的生物类群的重要原因。翅的特征也是研究分类和演化的重要依据。随着分子生物学的发展,迄今已取得了大量关于昆虫翅发育的研究成果,并表明翅发育的基本机制在昆虫间是比较保守的。但在漫长的进化历程中,主要由于自然选择的结果,昆虫翅的形态和功能出现了许多不同的类型,这些形态上的差异究竟源于哪些遗传信息的改变?其中的分子调控机制又是怎样的?这些问题需要深入研究。家蚕是鳞翅目昆虫的典型模式,也是目前完成基因组测序的唯一一种鳞翅目昆虫。家蚕翅发育相关基因的研究,对昆虫生理学、发育生物学以及生物进化等都具有重要的价值。家蚕在长期的人工选择压力下,已丧失了飞行能力,翅上斑纹严重退化,通过研究参与家蚕翅发育的基因,为揭示家蚕翅功能整体退化的分子机理奠定重要理论基础,对鳞翅目害虫的生物防治有重要意义。本研究借鉴模式生物果蝇关于翅的研究成果,利用家蚕的全基因组序列、ESTs以及基因芯片数据,对家蚕翅发育相关基因进行了生物信息学分析,同时采用克隆、RT-PCR、原位杂交和RNA干涉等技术对部分基因的表达以及功能进行了研究。获得的主要结果如下:1.家蚕翅模式决定基因的生物信息学分析前后轴和背腹轴两个级联调控途径对果蝇翅模式形成起着非常重要的作用,其中主要包括22个基因。通过同源检索,我们发现除vestigial（vg）基因外,其余21个基因在家蚕基因组中均存在同源基因。这些决定翅模式形成的基因大多在蝴蝶中也都有报道。这一结果表明,鳞翅目和双翅目昆虫翅模式决定的级联调控途径比较保守。分析家蚕和果蝇翅模式决定基因的结构和功能域,结果表明相应基因功能域序列相似性很高,进一步说明它们在翅发育中扮演着较为相似的角色。同时。部分基因（如Ubx,Dll等）在功能域外也表现目（如双翅目）的特异性。推测是由于昆虫在进化过程中翅的形态发生分化,相应基因的功能及其调控方式略显差异,使得在进化中其基因结构渐渐分化而表现出各自种群的特征。2.家蚕翅的形态发生与基因表达模式研究以N4为实验材料,观察家蚕5龄幼虫到化蛾前各时期翅原基及蛹翅（翅芽）的形态特征,表明5龄幼虫翅原基生长缓慢;蚕老熟后翅原基则迅速生长,其上的气管明显增多:化蛹前（W2末期）,翅原基已经展开,与蛹初期翅芽大小相当。化蛹后,蛹的翅芽包被于表皮之下,整个蛹期,翅芽的大小和形状都没有太明显的变化,只是翅芽发育逐步完善的过程,包括翅脉的硬化、鳞片的形成、花纹的出现等。在化蛹后第2d（P2）始见翅脉逐步形成,第3d（P3）可见翅芽的边缘出现初生的鳞毛,第6d（P6）鳞毛和翅脉基本形成。同时,对5龄幼虫的翅原基进行石蜡组织切片,调查了在发育过程中翅原基内部结构的变化。基于对家蚕翅模式决定基因的生物信息学分析结果,调查这些基因在翅发育过程中的表达模式。结果显示决定翅模式的基因在家蚕翅发育过程中都有大量表达。幼虫期,多数基因的表达量都呈逐渐升高的趋势;化蛹后,其表达量逐渐降低;羽化前,几乎所有这些基因都不再表达。从整体上看,这些基因的表达高峰主要集中在幼虫末期到化蛹初期,如wg,hh,srf,fng等。形态观察的结果表明这段时期正是翅原基形态发生巨大变化的时候,推测这些基因的高表达与翅原基的形态变化有关。同时部分基因在化蛹后仍维持较高水平的表达,如inv,fng,cut,wg等,推测可能是因为这些基因除了决定翅的模式外还参与后期翅的形态特化,如翅脉、鳞毛和斑纹的发育等。3.翅叶发育重要基因Bmwnt-1的研究参考人、果蝇、海葵的38个Wnt蛋白序列,通过序列比对,在家蚕9倍基因组中,找到9个同源基因,基于序列相似性,将其命名为:Bmwnt1,Bmwnt4A,Bmwnt5B,Bmwnt6,Bmwnt7,Bmwnt10A,Bmwnt10B,Bmwnt11和Bmwnt11A。在不同物种中,Wnt基因的数量不同。人的基因组有19个Wnt基因、低等的海葵有12个。而在昆虫（家蚕、果蝇和赤拟谷盗）中,Wnt基因的数量偏少,推测Wnt基因在进化过程中可能有基因丢失的现象,尤其在昆虫中。但Wnt的基因结构在进化过程中是比较保守的,常以成串的方式排列。家蚕有2个Wnt基因簇,Wnt11-Wnt1-Wnt6-Wnt10和Wnt7-Wnt5B-Wnt4,分别位于4号和28号染色体上。家蚕的Bmwnt-1基因是Wnt1亚型的一个同源体。分析双翅目和鳞翅目昆虫的Wnt1蛋白的分子结构,发现尽管Wnt-1蛋白在不同物种内都有较保守的结构域,但在进化过程中该结构域也在不断地分化,在目间表现山明显的差异性。对Bmwnt-1基因在翅发育过程中的表达谱分析表明,Bmwnt-1在5龄幼虫的翅原基中的表达量较高,一直持续到上簇后第2d（W2）,化蛹后,Bmwnt-1的表达量逐渐降低。用Bmwnt-1dsRNA沉默该基因在翅原基中的表达,出现翅叶部分缺失,甚至完全消失的突变表型,不能很好的形成翅叶。由此说明家蚕的Bmwnt-1控制翅叶的发育。4.家蚕AS-C complex的研究鉴定了家蚕AS-C复合物,包括BmASH、BmASH2、BmASH3和Bmase 4个基因。通过序列的同源性分析得出家蚕BmASH、BmASH2、BmASH3是原神经基因,Bmase是神经前体基因。进化分析表明,AS-C complex的祖先最初就分化为原神经基因和神经前体基因。在大多数的昆虫中都只有这2个AS-C基因。但双翅目昆虫中,AS-C complex经历基因重复后分化出了4个基因,本研究发现家蚕有4个AS-C基因,是除双翅目以外的首例发现。不同物种中,尽管AS-C基因数目不同,但AS-C complex及其两侧基因的结构是非常保守的,遵循着一定的排列方式,即原神经基因位于神经前体基因的上游,在AS-C complex的两侧紧挨着一个yellow基因和一个细胞色素基因cyt P450。用半定量RT-PCR调查了4个AS-C基因在家蚕不同组织中的表达情况,发现其在翅原基中的表达量明显高于其他组织。进一步检测它们在翅发育过程中的表达,结果表明这4个AS-C基因都有较高的表达水平,其中BmASH2和BmASH3基因的表达模式非常相似,呈现共表达的趋势。在蝴蝶里,鳞毛前体细胞的第一次细胞分裂发生在化蛹后的24h左右,bASH1基因（蝴蝶AS-C的同源基因）在此时大量表达。在家蚕中,对应的时期里高表达的是BmASH基因,推测家蚕的BmASH基因与鳞毛的分化关。我们用RNAi研究BmAsh基因的功能,BmASH基因干涉后出现翅表面部分区域鳞片缺失的现象,且该区域毛孔也极少。表明BmASH基因在家蚕翅鳞毛的形成过程中起着至关重要的作用。5.BmSRF基因的功能研究克隆家蚕的血清应答因子BmSRF基因。BmSRF基因在翅发育过程的表达模式分析和翅原基中的原位杂交结果都表明,该基因参与翅的发育,主要的作用时期是化蛹后1、2d（P1、P2）。说明BmSRF基因对翅的形态特化具有非常重要的作用。我们用BmSRF dsRNA沉默该基因在翅原基中的表达,出现了翅叶上有囊泡和翅脉增多这两种突变表型,同时还伴有鳞毛增多的现象。初步认为BmSRF对翅的上下表皮的粘合和脉络的形成有重要作用。BmSRF基因干涉后出现了囊泡型翅的突变表型。该表型与家蚕突变螯虾蛹（cf）的表型较为相似,这引起了我们探究家蚕螯虾蛹突变形成原因的极大兴趣。通过对螯虾蛹和正常型翅原基的解剖,我们观察到在上簇后第1d（W1）,突变型cf的翅原基中的气管的数量明显比野生型多,且较野生型显得凌乱,生出一些微气管。进一步对该时期二者的翅原基进行切片,观察发现在W1期野生型翅原基中气管发生迁移,而突变体cf的翅原基中其气管在迁移过程中极度拉长,并伴有气管融合的现象。鉴于此,我们用定量PCR检测了BmSRF基因在突变型cf和野生型翅发育过程中的表达情况。结果显示在突变型cf里BmSRF基因的表达水平比野生型高,尤其在上簇后第1d（W1）。这与我们对二者翅原基的形态观察结果一致,说明W1期是突变体cf形成的重要时期,推测BmSRF基因在该时期的过量表达或许是导致突变体cf形成的一个重要原因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 昆虫翅发育的研究进展
• 1.2.1 翅发育机制的研究进展
• 1.2.2 昆虫翅突变的研究进展
• 1.3 决定翅发育模式相关基因的研究进展
• 1.3.1 wingless基因的研究进展
• 1.3.2 achaete-scute complex的研究进展
• 1.3.3 serum response factor（SRF）基因的研究进展
• 1.3.4 其他翅模式决定基因的功能
• 1.4 家蚕翅发育的研究进展
• 1.4.1 家蚕翅发育的形态学研究
• 1.4.2 家蚕翅发育的分子水平研究进展
• 1.4.3 家蚕翅突变的研究进展
• 第二章 引言
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 主要研究内容
• 2.2 研究路线
• 第三章 家蚕翅模式决定基因的生物信息学分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 数据来源
• 3.1.2 软件
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 第四章 家蚕翅的形态发生与基因表达
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 家蚕五龄幼虫翅原基及蛹期翅芽形态的变化
• 4.2.2 家蚕翅原基的组织切片
• 4.2.3 翅模式决定相关基因在家蚕翅不同发育时期的表达
• 4.3 讨论
• 4.3.1 家蚕翅的形态发生规律
• 4.3.2 家蚕与果蝇翅形态发生的比较
• 4.3.3 家蚕翅模式决定相关基因的表达与翅形态发生的关系
• 第五章 家蚕翅叶发育基因Bmwnt-1的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 家蚕Wnt蛋白家族的结构及进化分析
• 5.2.2 Bmwnt-1基因在家蚕翅发育中的表达模式
• 5.2.3 家蚕Bmwnt-1基因在翅发育过程中的RNAi研究
• 5.3 讨论
• 5.3.1 家蚕Wnt蛋白家族进化
• 5.3.2 家蚕Bmwnt-1基因在翅发育中的功能
• 第六章 家蚕AS-C同系物的鉴定、表达及功能研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.3 实验仪器
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 家蚕AS-C同系物的鉴定
• 6.2.2 家蚕AS-C同系物的基因组结构及进化分析
• 6.2.3 家蚕AS-C同系物基因在家蚕中的时空表达
• 6.2.4 家蚕AS-C基因在翅发育过程中的RNAi研究
• 6.3 讨论
• 6.3.1 AS-C同系物的高度保守性
• 6.3.2 家蚕AS-C同系物基因的功能
• 第七章 家蚕BmSRF基因的克隆、mRNA表达及功能研究
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.1.3 主要仪器
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 家蚕BmSRF基因的克隆及序列分析
• 7.2.2 BmSRF基因的时空表达
• 7.2.3 BmSRF基因在家翅原基中的原位杂交
• 7.2.4 家蚕BmSRF基因在翅发育过程中的RNAi研究
• 7.2.5 家蚕突变型cf与家蚕野生型翅（翅原基）的形态差异
• 7.2.6 BmSRF基因在突变型cf与野生型家蚕翅原基中的表达差异
• 7.3 讨论
• 7.3.1 BmSRF基因在进化中的保守性
• 7.3.2 家蚕BmSRF基因在翅发育中的功能
• 7.3.3 家蚕cf突变体形成原因初探
• 第八章 综合与结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表文章及参研课题情况
• 致谢