骨髓间充质干细胞与硫酸钙/脱钙骨基质构建组织工程骨并修复骨缺损的实验研究

论文摘要

目的：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs），观察TGF-β1和bFGF对MSCs增殖和成骨分化的影响；将MSCs与硫酸钙/脱钙骨基质（DBM）复合物构建组织工程骨，并观察其修复大鼠桡骨骨缺损的能力，探讨骨缺损治疗的骨组织工程学方法。方法：（1）采用贴壁法分离、培养MSCs，观察其生物学特性，绘制生长曲线；流式细胞技术对MSCs表型进行鉴定；成骨诱导剂体外诱导成骨分化，行碱性磷酸酶染色，ALP活性测定。并将培养细胞冻存、复苏，观察复苏后特性有无改变。透射电镜观察成骨分化前后的改变。（2）体外培养时分别加入不同浓度TGF-β1和bFGF，通过MTT法检测生长因子对MSCs增殖的影响，通过RT-PCR技术测定碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（Osteocalcin，OCN）和骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）的表达了解生长因子对MSCs成骨分化的影响。（3）大鼠MSCs体外培养扩增、成骨诱导后，以2×106/ml的密度与硫酸钙/DBM复合物构建组织工程骨，体外培养5天后，扫描电镜观察细胞与材料复合情况，同时行大鼠皮下异位成骨实验，于术后8周行X线检查和组织学观察。（4）将60只成年SD大鼠随机分为4组，每组15只，制成单侧桡骨5mm的骨缺损模型，各组分别按下列方法修复骨缺损，A组：材料+MSCs（tGF-β1和bFGF处理）；B组：材料+MSCs（无TGF-β1和bFGF处理）；C组：单纯材料组；D组：空白对照组。术后4和8周各组分别处死5、10只动物并取材，行大体形态学、组织学、X线和生物力学检查。结果：（1）MSOs体外培养9代以前生长性状稳定，冻存复苏后细胞生物学行为无改变。体外培养的第3代MSCs流式细胞技术检测CD90、CD44阳性，CD31、CD45阴性。成骨诱导分化后碱性磷酸酶染色阳性，ALP活性增高，电镜显示诱导后MSCs体积增大，近椭圆形，胞浆丰富，核浆比变小，各细胞器含量丰富，功能活跃。（2）体外培养过程中低浓度的TGF-β1和bFGF促进MSCs增殖，而高浓度的TGF-β1和bFGF抑制MSCS增殖；TGF-β1（1ng/ml）和bFGF（10ng/ml）促进MSCs的OCN和OPN表达增加。（3）MSCs与硫酸钙/DBM复合后5天，细胞与支架表面和孔隙可实现良好复合，扫描电镜观察到细胞基质分泌旺盛，充满支架孔隙。大鼠皮下异位成骨实验证明其成骨效果良好。（4）组织工程骨修复大鼠桡骨骨缺损术后8周结果显示A组、B组的成骨能力明显强于C组，尤以A组的成骨量最多，而D组仅在骨折断面处生成少量松质骨，缺损区由纤维组织填充，骨缺损不能修复。生物力学实验显示A组、B组骨骼强度明显高于于C组和D组，相比较有显著性差异。结论：MSCs是一种理想的骨组织工程种子细胞，低浓度的TGF-β1和bFGF可促进其增殖和成骨分化，硫酸钙/DBM是一种良好的载体支架材料，与MSCs复合构建组织工程骨后能明显提高骨生成速度，在修复节段性骨缺损方面具有潜在的临床应用价值。

论文目录

• 一、缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• 前言
• 第一部分: 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定和成骨分化的研究
• 1、碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响'>第二部分: 转化生长因子-β₁、碱性成纤维细胞生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响
• 第三部分: 硫酸钙/脱钙骨基质复合物构建组织工程骨的研究
• 第四部分: 组织工程骨修复大鼠桡骨骨缺损的研究
• 五、研究总结
• 六、综述
• 骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
• 七、致谢