论文摘要
病害、干旱、盐碱等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子,也是影响作物产量的主要胁迫因素,因此克隆抗病抗逆相关基因并利用这些基因改良作物的抗病抗逆性具有重要的意义。烟草不仅是一种模式作物,还是一种重要的经济作物,烟草花叶病毒（TMV）是烟草中广泛传播的一种病毒,世界各烟区普遍发生,严重影响了烟草的品质和产量,因此,筛选高抗TMV的烟草材料,并对其中的抗性基因进行表达特性分析及功能鉴定具有重要意义。另一方面,AP2/ERF转录因子广泛存在于不同的植物物种中,如:拟南芥、番茄、烟草和水稻,参与调控干旱、高盐、低温、病害和细胞发育相关的基因表达,转录因子作为调控基因能够调控多个下游功能基因的表达,从而使转基因植物获得综合抗病抗逆能力,克隆和转化这些转录因子具有较高的应用价值。本文主要分两部分对植物抗病抗逆基因进行研究:1,利用同源基因克隆技术从高抗TMV的中国地方烟草种质HZNH中克隆到一个抗病相关基因,对此基因进行了表达特性分析及功能鉴定;2,利用生物信息学方法,对TIGR大豆基因索引数据库进行搜索,从中获得具有AP2/ERF结构域的序列,并对其进行生物信息学分析和表达特性分析,从中选取在不同胁迫条件下,表达都较好的基因进行进一步的研究。具体内容如下:1,CN基因的克隆及基因结构分析:利用同源基因扩增技术从高抗TMV的中国地方烟草种质HZNH中克隆到一个新的基因,命名为CN基因。CN基因的编码区为3423bp,同N基因有93.63%的核苷酸序列一致性,其编码蛋白属于TIR/NBS/LRR类。基因组CN基因由5个外显子和4个内含子组成,外显子序列同N基因具有较高的序列一致性,但内含子区在序列和长度上明显不同。2,CN基因的表达特性分析及功能鉴定:CN基因的表达受TMV诱导并具有温度敏感性,其表达时间先于PRla基因的表达。选择性剪切分析表明CN基因的内含子3不存在选择性剪切。组织特异性表达分析表明:CN基因在叶中表达量较高,在茎中表达量较低,在根中表达量最低。通过农杆菌介导的方法将CN基因转入感TMV烟草K326,转基因烟草在TMV接种后表现出超敏反应和系统性超敏反应。3,大NAP2/ERF家族转录因子的生物信息学分析:用AP2/ERF结构域的种子模型对TIGR大豆基因索引数据库进行筛选,从中获得148个含AP2/ERF结构域的TC/EST序列,其中26个属于AP2家族成员,2个属于RAV家族成员,120个属于ERF家族成员。在120个ERF家族成员中,有98个成员含有完整的AP2/ERF结构域,将这98个大豆ERF家族成员和拟南芥ERF家族成员的序列进行比对及系统进化分析,结果表明ERF家族成员的AP2/ERF结构域在大豆和拟南芥中是非常保守的,用于拟南芥ERF家族成员的分类方法也可以用于大豆ERF家族成员的分类,根据Sakuma et al.（2002）的分类,可将大豆ERF家族分为两个主要的亚家族,DREB亚家族和ERF亚家族。其中,DREB亚家族又可分为六个亚组A1-A6,ERF亚家族也可分为6个亚组B1-B6。大豆ERF家族成员在AP2/ERF结构域外除和拟南芥分享一些共有的保守基序外,还有一些特异的保守基序,这些特有的保守基序可能在大豆的生长发育过程中起重要作用。4,ERF亚家族成员的表达特性分析:从ERF亚家族的6个亚组中,选取10个unigenes进行表达特性分析,RT-PCR结果表明大豆花叶病毒（SMV）作为生物胁迫可诱导其中7个unigenes的表达;干旱、低温和高盐作为非生物胁迫分别诱导10个、6个和10个unigenes的表达;SA、ET、JA和ABA作为植物激素则能诱导所有10个unigenes的表达。5,GmERF3基因和GmERF4基因的体外结合特异性分析:从10个已被分析了表达特性的unigene中,我们选取两个在不同生物和非生物胁迫下,表达情况都较好的基因,分别命名为GmERF3和GmERF4,进行进一步的分析。凝胶阻滞实验结果表明,GmERF3和GmERF4蛋白在体外都能与GCC box和DRE/CRT元件结合,不能与突变GCC或DRE/CRT结合,表明这两个基因可能同时应答生物与非生物胁迫,参与多种信号路径。6,GmERF3基因和GmERF4基因的亚细胞定位分析:通过基因枪法分别将含GmERF3基因和GmERF4基因的亚细胞定位重组载体转化洋葱表皮细胞,暗培养24h后共聚焦显微镜下观察,验证他们是否具有核定位功能。结果表明:GmERF3和GmERF4基因都能定位于细胞核,可通过自身的NLS进入核内行驶功能。7,GmERF3基因的自激活验证:利用网上数据库,预测GmERF3蛋白可能的修饰位点,根据预测结果把GmERF3基因分成四个区段,分别克隆到酵母双杂交系统的诱饵载体（pGBKT7）上,通过酵母的自激活实验确定诱饵区段。实验表明GmERF3基因具有较强的自激活活性,所分四个区段不仅能在SD/-Trp/-His/-Ura/-Ade培养基上生长,甚至还能在SD/-Trp/-His/-Ura/-Ade/15mM 3AT培养基上生长。8,GmERF3和GmERF4基因的功能鉴定:通过农杆菌侵染的叶盘转化法,分别将GmERF3和GmERF4基因转化模式植物烟草,并对后代进行检测。鉴定结果表明:GmERF3基因能提高转基因烟草对非生物胁迫干旱和高盐的耐受,但是并不对冷胁迫产生耐受;对于生物胁迫,转GmERF3基因明显提高了转基因烟草对细菌性病原菌青枯菌和真菌性病原菌赤星菌的抗性,对于病毒性病原菌TMV,转基因烟草和野生型烟草相比接种叶片的坏死斑产生时间一致,且无坏死斑大小和数量的差异,但是转基因植株顶部叶片的坏死时间明显比野生型延迟。转GmERF4基因的烟草,也提高了转基因植株对非生物胁迫干旱和高盐的耐受,但是并没有提高对生物胁迫的耐受。综上所述,本研究克隆了CN基因和2个ERF亚家族的转录因子基因,并对其分子生物学特性进行了分析,他们的过表达提高了转基因烟草抗生物或非生物胁迫的能力,为利用基因工程的方法改良作物的抗病抗逆性提供了优良的候选基因。