论文摘要
目的研究叶酸对大鼠胎鼠、新生鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖分化中Notch和MAPK信号通路相关基因及蛋白表达作用的机制。方法采用孕14-16d SD胎鼠及24h内同窝新生鼠全脑,进行NSCs原代培养。在正常培养条件下,分为4组:①对照组;②叶酸缺乏组,添加甲氨蝶呤为0.4μg/ml;③叶酸低剂量组,添加叶酸为4μg/ml:④叶酸高剂量组,添加叶酸为40μg/ml。在加入MAPK通路抑制剂U0126的条件下,分为4组:①对照组:②U0126组,只添加U0126为10μM;③U0126+低剂量叶酸组,添加U0126为10μM同时添加叶酸为4μg/ml:④U0126+高剂量叶酸组,添加U0126为10μM同时添加叶酸为40μg/ml。增殖第6d收集一半细胞,另一半加入含血清培养液继续培养6d,诱导细胞分化,第13d收集分化的细胞。叶酸、甲氨蝶呤等试剂均用培养液配制。首先按正常条件培养神经干细胞,每次换液加入叶酸时即加入10μM的U0126。采用克隆、酶切与测序等方法对RT-PCR产物进行鉴定:采用实时定量SYBR Creen I-PCR方法,测定NSCs MAPK信号通路相关基因（ERK1、ERK2）mRNA表达情况:采用Western Blot方法,正常培养条件下Notch信号通路相关蛋白（Notch1、HES5、Neurogenin1）的表达情况和加入MAPK通路抑制剂U0126条件下,该通路中相关蛋白（pERK1、pERK2）的表达情况。结果1、普通RT-PCR扩增产物经克隆、酶切、测序显示,特异性好,扩增片段与预期结果相符。2、SYBR Creen I-PCR结果显示,在加入MAPK通路抑制剂U0126的条件下,叶酸对胎鼠增殖期NSCs ERK1/2 mRNA表达的影响各组之间无统计学差异（P＞0.05）;叶酸对新生鼠增殖期NSCs ERK1/2 mRNA表达的影响,某些组间虽有统计学差异,但没有一定的规律,体现不出叶酸的作用。3、Western Blot方法对正常培养条件下Notch信号通路和加入MAPK通路抑制剂U0126条件下该通路中相关蛋白进行了检测,结果显示:（1）Notch通路增殖期补充叶酸能够促进NSCs Notch1、HES5蛋白的表达（P＜0.05）,分化晚期补充叶酸能够降低Neurogenin1蛋白的表达（P＜0.05）,同时也能增加HES5蛋白的表达（P＜0.05）。（2）MAPK通路无论增殖期分化期,叶酸对胎鼠及新生鼠NSCs pERK1、pERK2蛋白表达的影响均无统计学差异（P＞0.05）。结论1、在正常培养条件下,叶酸可能通过上调增殖期胎鼠、新生鼠NSCs Notch信号通路中Notch1、HES5蛋白的表达促进神经干细胞的增殖;而在NSCs的分化晚期,叶酸再一次上调HES5蛋白的表达,下调Neurogenin1蛋白的表达,促进NSCs向星形胶质细胞分化。2、在加入MAPK通路抑制剂U0126条件下,叶酸对增殖期胎鼠、新生鼠NSCs ERK1/2mRNA的表达影响不明显;对增殖分化期胎鼠、新生鼠NSCspERK1、pERK2蛋白的表达影响也不明显。3、在正常培养条件下,叶酸40μg/ml剂量组与4μg/ml剂量对胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化中Notch通路中相关蛋白的调节作用基本一致;同样,在加入MAPK通路抑制剂U0126条件下,这两个剂量组对胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化MAPK通路中相关蛋白表达的调节作用也基本一致。因此,叶酸可能通过影响Notch和MAPK信号通路中相关基因及蛋白的表达从而促进NSCs的增殖、分化,这对神经系统损伤和神经退行性疾病的治疗开辟新的途径。