双标记系统及转座系统在阿维链霉菌中的应用

论文摘要

阿维菌素（avermectin）是一种由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）产生的具有抗寄生虫、杀螨虫和农业害虫活性的大环内酯类抗生素。其独特的生理活性以及高效低毒无残留的特点使其在农业、畜牧业及医药等领域得到广泛应用。阿维链霉菌作为一种重要的工业微生物,其中得以应用的高效遗传操作工具却相对较少,而这在一定程度上制约了阿维菌素生物合成调控的研究。本研究在阿维链霉菌中构建了以neo和actⅡ-4/act△actⅡ-4为标记的双标记系统,尝试用标记基因的表达来指示阿维菌素的生物合成。该系统将不含启动子的基因neo和actⅡ-4串联置于阿维菌素生物合成基因簇中,同时将act△actⅡ-4整合到染色体上,因此,neo-actⅡ-4的表达依赖于阿维菌素生物合成基因簇内的上游基因。neo赋予宿主卡那霉素抗性,而actⅡ-4的表达,可以激活actAactⅡ-4的表达,贼予宿主产生放线紫红素的能力而使得菌体呈现蓝色。在该系统的测试中,本研究发现,标记neo顺利表达,而标记actⅡ-4/act△actⅡ-4的表达却受到诸多限制。本研究用NTG诱变阿维链霉菌双标记菌株PX1的方法来筛选阿维菌素高产菌株。在卡那霉素筛选条件下,20.00%突变菌株的阿维菌素产量有所提高、表型与PX1菌株一致。而5.43%的突变菌株呈现蓝色,均为光秃表型,几乎不产生阿维菌素。转座子作为一种有效的研究功能基因的工具而倍受青睐。本研究根据阿维链霉菌的遗传操作特性,尝试构建了一系列转座载体。自杀型转座载体pHHL734难以通过大肠杆菌链霉菌属间接合转移进入阿维链霉菌。因此,在此基础上分别添加链霉菌复制子oriSCP2*和oripIJ101,二者在阿维链霉菌中均不稳定,丢失频率分别为76.00%和99.96%。而为了提高转座突变菌株的筛选效率,在转座载体中分别引入codA和Ⅰ-SceⅠ标记用于转座突变的筛选。前者因阿维链霉菌对5-氟胞嘧啶的较强抗性而无法得以应用,而后者在一定程度上可以起到筛选作用。本研究构建的转座系统在高通量筛选阿维链霉菌的转座突变菌株中遇到了一定的困难,转座系统有待进一步改进以提高转座效率。另外,本研究还尝试将Ⅰ-SceⅠ标记引入基因中断载体,用于无选择标记的基因中断菌株的构建。本研究利用该载体,成功地敲除了阿维链霉菌中参与黑色素合成的基因簇之一的melC2-melC1,目标突变菌株的筛选频率达到9.09%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 1. 文献综述
• 1.1 链霉菌（Streptomyces）简介
• 1.2 模式菌株天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor A3（2））简介
• 1.3 阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）简介
• 1.3.1 阿维菌素生物合成基因簇
• 1.3.2 阿维链霉菌的生物合成途径
• 1.3.3 阿维链霉菌的全基因组测序
• 1.3.4 阿维菌素的生物合成调控机制
• 1.4 阿维菌素高产菌株的选育
• 1.5 阿维链霉菌中的转座研究
• 1.6 本研究的工作基础、目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基及生化试剂
• 2.1.5 抗生素
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 链霉菌培养及菌种保藏
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的快速检测
• 2.2.4 链霉菌总DNA的提取
• 2.2.5 大肠杆菌链霉菌属间接合转移
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.7 Southern杂交
• 2.2.8 DNA片段凝胶回收
• 2.2.9 TA克隆
• 2.2.10 PCR
• 2.2.11 阿维链霉菌的发酵
• 2.2.12 阿维链霉菌的NTG诱变
• 2.2.13 阿维菌素的HPLC测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 阿维链霉菌双标记系统的构建
• 3.1.1 双标记系统简介
• 3.1.2 双标记系统质粒的构建
• 3.1.3 双标记菌株PX1的构建
• 3.1.4 双标记菌株PX1的发酵
• 3.1.5 双标记菌株PX1中双标记系统测试
• 3.2 基于双标记系统的阿维菌素高产菌株选育
• 3.2.1 双标记菌株的NTG诱变
• 3.2.2 诱变菌株的表型观察
• 3.2.3 诱变菌株的发酵
• 3.3 归位内切酶I-SceI标记在阿维链霉菌基因中断中的应用
• 3.3.1 归位内切酶I-Scel简介
• 3.3.2 携带I-SceI标记的基因中断载体的构建
• 3.3.3 携带I-SceI标记的基因中断载体的改进
• 3.3.4 携带I-SceI标记的基因中断载体在阿维链霉菌中的应用
• 3.3.4.1 melC2-melC1基因簇敲除载体的构建
• 3.3.4.2 阿维链霉菌中melC2-melC1基因簇的敲除
• 3.3.4.3 阿维链霉菌melC2-melC1基因簇缺失菌株的验证
• 3.4 阿维链霉菌中转座载体系统的研究
• 3.4.1 自杀型载体pHL734在阿维链霉菌中的应用
• 3.4.2 复制型转座载体在阿维链霉菌中的应用
• 3.4.2.1 复制型转座载体pHL754的构建
• 3.4.2.2 复制型转座载体pHL754丢失频率测试
• 3.4.2.3 复制型转座载体pHL754转座突变菌株的筛选
• 3.4.3 引入负筛选标记codA的复制型转座载体的应用
• 3.4.3.1 负筛选标记codA简介
• 3.4.3.2 携带负筛选标记codA的转座载体pHL755的构建
• 3.4.3.3 链霉菌中5-FC的MIC测试
• 3.4.3.4 转座载体pHL755在阿维链霉菌中的应用
• 3.4.4 携带I-SceI标记的复制型转座载体的应用
• 3.4.4.1 携带I-SceI标记的复制型转座载体pHL764的构建
• 3.4.4.2 转座载体pHL764在天蓝色链霉菌中的转座测试
• 3.4.4.3 接合转移子M145/pHL764的PCR验证
• 3.4.4.4 接合转移子M145/pHL764的测序验证及分析
• 3.4.4.5 转座载体pHL764在阿维链霉菌中的转座测试
• 3.4.5 携带I-SceI标记的复制型转座载体的改进
• 3.4.5.1 携带oripIJ101复制子的转座载体pHL765的构建
• 3.4.5.2 转座载体pHL765丢失频率计算
• 3.4.5.3 转座载体pHL765在阿维链霉菌中的应用
• 3.4.5.4 阿维链霉菌接合转移子NRRL8165/pHL765的测序验证及分析
• 4. 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 4.3 展望
• 参考文献
• 致谢