论文摘要
目的1.对视网膜Muller细胞的原代培养方法加以改良,建立简单快捷的分离培养Muller细胞的方法。2.通过体外去分化诱导,探讨大鼠视网膜Muller细胞干细胞潜能的激活条件及调控机制。3.研究Wnt和Notch信号通路在Muller细胞去分化的调控作用。方法1.取新生5-7天SD大鼠,显微镜下分离视网膜,直接吹打成微小组织悬液后置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM/F12（1:1）培养基中培养,8-10天后行第一次换液,之后2-3天换液一次至细胞完全融合后进行传代。免疫荧光组织化学检测Muller细胞标志物谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）和波形蛋白（Vimentin）的表达进行细胞鉴定,使用FACS对所得细胞进行纯度检测。2.取第3代视网膜Muller细胞,更换含DMEM/F 12（1:1）,1*N2 supplement, 2*B27 supplement,20 ng/ml表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）,10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的无血清去分化培养基培养3-5天。倒置相差显微镜下观察去分化后细胞的形态特征,免疫荧光组织化学,Real time RT-PCR以及Western blotting检测神经干细胞标志物Nestin, Musashi-1以及视网膜干细胞标志物Pax6的表达情况。CCK-8法检测去分化后细胞的增殖能力。更换含1*N2 supplement,2*B27 supplement,10%FBS的DMEM/F 12培养基对去分化后的细胞进行再分化诱导,免疫荧光组织化学检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表达情况。3. Real time RT-PCR检测Wnt和Notch信号通路的相关分子Fzdl,Fzd2,Lefl, Notchl, Delta 1和Hesl在Muller细胞去分化培养前后的mRNA水平,并于去分化培养的第0,1,2,3,4,5天分别收集细胞行Western blotting检测Wnt2,β-catenin, Notch 1, Pax6和Nestin的蛋白水平。4.使用通路激动剂（Wnt-3a, Notch 1）和抑制剂（Dkk-1, DAPT）对Muller去分化培养过程中的Wnt和Notch信号通路进行干预,观察Muller细胞去分化的情况,FACS检测各组去分化前后视网膜干细胞标志物Pax6阳性细胞的百分率。CCK-8检测各组中,神经球细胞的自我增殖能力。结果1.原代培养的Muller细胞胞体狭长,胞浆丰富,免疫荧光检测结果显示,97.2±1.43%的细胞GS染色阳性,90.3±2.17%的细胞Vimentin染色阳性。流式细胞检测显示传3代后的细胞99.7% GS表达阳性。2.去分化培养3-5天后,大部分Muller细胞克隆生长成神经球状,免疫荧光组织化学检测显示,细胞球Nestin, Musashi-1及Pax6染色阳性。Real time RT-PCR的结果显示,细胞球中Pax6的mRNA水平较Muller细胞增加了-5.57倍,Nestin的mRNA水平增加了-3.98倍,差异有统计学意义（p<0.05）。Western blotting结果显示,神经球细胞中的Pax6和Nestin的蛋白表达水平较Muller细胞有明显升高。FACS结果显示,去分化前的Muller细胞中Pax6和Nestin的阳性率分别为7.8%和7.3%,去分化后的细胞为80.2%和60.4%。CCK-8检测显示,神经球细胞可以自我增殖,同时经再分化诱导培养后表达胶质细胞标志物GFAP。3. Real time RT-PCR结果显示,神经球细胞中Wnt和Notch通路相关基因的mRNA水平较Muller细胞明显升高,其中Fzd1为-2.44倍,Fzd2为-2.82倍,Lef1为-4.62倍,Notch 1为-3.24倍,Delta1为-2.64倍,Hes1为-5.71倍,差异具有统计学意义（p<0.05）。Western blotting结果显示,从d0到d5,Wnt2,β-catenin, Notch 1, Pax6和Nestin蛋白的表达逐渐增强,通路相关蛋白Wnt2,P-catenin及Notch 1与干细胞标志物Pax6及Nestin的表达存在时间的一致性。4.在添加Wnt-3a和Notch 1组中,神经球的数量明显增加,体积增大,添加Dkk-1和DAPT组中,神经球数量较少,细胞增殖缓慢。FACS结果显示,在Wnt-3a+Notchl组中,Pax6阳性的细胞为94.1%,Wnt-3a组中为87.1%, Notchl组中为76.2%,均较对照组的63.7%有所升高,在Dkk-1组中Pax6阳性细胞为38.4%, DAPT组中为31.7%,均较对照组明显下降。CCK-8检测结果显示,在Wnt-3a+Notchl组,Wnt-3a组和Notchl组中,细胞增殖速度均较对照组快,在Dkk-1组和DAPT组中,细胞增殖速度较对照组下降。结论1.改良后的培养方法可以简单快捷的分离纯化视网膜Muller细胞。2.生长因子的刺激可以在体外激活视网膜Miiller细胞的干细胞特性,Muller细胞很可能成为视网膜干细胞的一种潜在来源。3. Muller细胞去分化后形成神经球样结构,表达神经干细胞的标志物,并具备自我增殖和再分化的能力。4. Wnt和Notch言号的上调可以促进Muller细胞向神经干细胞去分化,同时促进神经干细胞球的自我增殖。Wnt和Notch信号通路在Muller细胞去分化的过程中存在协同调控作用。