白术多糖及其硫酸化衍生物的抗病毒和增强免疫活性的比较

论文摘要

越来越多的研究发现,通过分子修饰多糖获得的多糖衍生物会产生或者增强某种生物活性,以硫酸化多糖研究较多。白术多糖是白术的一种重要成分,具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化等多种作用。本研究首先用一步醇沉和分步醇沉的方法获得白术总多糖和6种白术分级多糖,测定并筛选出体外抗病毒和增强免疫的活性部位,再进一步硫酸化修饰获得多糖硫酸化产物,比较修饰前后多糖生物活性的变化。试验分为6个部分：试验Ⅰ白术多糖的提取分别用水煎一步醇沉和水煎分步醇沉的方法从白术饮片中提取白术总多糖（total Atractylodes macrocephala polysaccharide, AMPt）和6种白术分级多糖AMP40、AMP50、AMP60、AMP70、AMP80、AMP90,分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定糖含量和蛋白含量。结果表明,各白术多糖的提取率最高的是AMPt为22.7%,最低的是AMP60,仅为0.842%；各白术多糖糖含量最高的是AMP50,89.2%,最低的是AMP90,59.52%；各多糖蛋白含量最高的是AMP40,为10.25%,最低的AMP80,为4.83%。试验Ⅱ白术多糖抗病毒活性的比较首先用MTT法测定白术总多糖（AMPt）和六种分级多糖（AMP40、AMP50、AMP60、AMP70、AMP80、AMP90）对鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）的安全浓度,然后取安全浓度内5个浓度的各多糖与鸡新城疫病毒（Newcastle disease, NDV）以3种加药方式（先加多糖后加病毒、先接病毒后加多糖、多糖和病毒感作后同时）加入到鸡胚成纤维细胞的培养体系中,测定NDV感染CEF能力的变化。结果表明,在先加多糖时,AMP80在3.907～7.813μg·mL-1均能抑制NDV感染CEF,且病毒抑制率高于其他各组；后加多糖作用时,各白术多糖在1.953～31.25μg·mL-1浓度范围内均能显著抑制NDV感染CEF,且AMP40病毒抑制率显著高于AMP60、AMP70、AMP90、AMPt；多糖和病毒感作后同时加入,AMP40、AMP70、AMP80在1.953μg·mL-1,AMP60在3.907μg·mL-1, AMP90、AMPt在1.953～3.907μg·mL-1均能显著抑制NDV感染细胞,AMP70高于其他多糖组。故筛选出抗新城疫病毒较好的多糖AMP40、AMP70、AMP80,推断可能为白术多糖抗病毒活性部位。试验Ⅲ白术多糖增强免疫活性的比较首先测定白术总多糖和6种分级多糖AMP40、AMP50、AMP60、AMP70、AMP80、AMP90对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度,然后以安全浓度内的5个浓度的各多糖单独或与PHA加入到淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,单独作用时,AMP40在31.25-62.5μg·mL-1, AMP50在500μg·mL-1, AMP70在31.25μg·mL-1250μg·mL-1, AMP80在125μg·mL-1、31.25μg·mL-1, AMP90在125-250μg·mL-1的A57o值显著大于细胞对照组（P<0.05）,说明它们能单独刺激淋巴细胞增殖,且AMP80增殖率高于其他多糖组；与PHA共同作用时,AMP40、AMP80在31.25-250μg·mL-1,AMP60、 AMP70在31.25-62.5μg·mL-1, AMP90在31.25、500μg·mL-1的浓度范围内的As7o值大于PHA对照组,说明它们能够协同PHA促进淋巴细胞增殖,且AMP80淋巴细胞增殖率显著高于AMP50、AMP60、AMP70、 AMP90、AMPt。结果表明,AMP80单独刺激作用和协同PHA作用最好,可能是白术多糖增强免疫的活性部位。试验Ⅳ白术多糖的硫酸化修饰条件的优选采用氯磺酸-吡啶法对纯化的白术总多糖进行硫酸化修饰,以产物回收率、糖含量和硫酸基取代度（substitution degree, DS）为指标以氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间为因素水平,用L9（3）4正交设计对修饰条件进行优选。结果显示：氯磺酸与吡啶的配比对于产物得率的影响最大,且比例在1：6产物量最高；反应温度对糖含量和取代度影响最大,糖含量随着温度的升高而降低,而取代度随着温度的升高而升高,由于70℃时产物量最高,综合考虑,温度取70℃作为硫酸化的反应温度；反应时间不是影响硫酸化产物的产物量、糖含量、取代度的主要因素,反应时间在1h产物量最高,综合考虑,白术多糖氯磺酸-吡啶法修饰的最佳条件为氯磺酸：吡啶为1：6,反应温度为70℃,反应时间为1h。试验V硫酸化白术多糖抗病毒活性的比较将前两章筛选出来的抗病毒活性较强的AMP40、AMP70、AMP80和增强免疫活性较强的AMP80与白术总多糖AMPt经过纯化后分别进行硫酸化修饰,制备sAMP40、sAMP70、sAMP80、sAMPt,测定这8种多糖在鸡胚成纤维细胞上的安全浓度,然后取其安全浓度范围内的5个浓度的各种多糖与新城疫病毒以3种不同的作用方式加入到CEF中,用MTT法测定各多糖抵抗NDV感染CEF的能力。结果显示：先加多糖后加病毒时,sAMP70的病毒抑制率为71.11%,显著高于未硫酸化多糖AMP40P （15.85%）. AMP70P （41.09%）、AMP80P（30.83%）、AMPt （23.38%）（P<0.05）,硫酸化多糖的病毒增殖率高低顺序为sAMP70>sAMPt>sAMP40>sAMP80;先加病毒后加多糖时,sAMP70的病毒抑制率为62.42%,高于其他多糖组,其次为sAMP40,其病毒抑制率为58.35%,且显著高于AMP40P（35.35%）；多糖和病毒感作后加入CEF时,sAMP80的病毒抑制率为88.45%,显著高于AMP40P （33.70%）、AMP70P （40.40%）、AMPtp （49.28%）（P<0.05）,并且高于AMP80P（67.92）。综合分析,硫酸化能提高白术多糖的抗病毒活性,以sAMP70抗病毒活性最好。试验Ⅵ硫酸化白术多糖增强免疫活性比较取安全浓度范围内5个浓度的AMP40P、AMP70P、AMP80P、AMPtp及其硫酸化产物sAMP40、sAMP70、sAMP80、sAMPt加入到外周血淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示：多糖单独作用于淋巴细胞时,硫酸化多糖各组的淋巴细胞增殖率分别高于未硫酸化各组,且sAMP70组的淋巴细胞增殖率最高为22.4%,显著大于未硫酸化多糖AMP40P、AMP70P、AMP80P、AMPtp;与PHA共同作用时,硫酸化多糖及AMP80P均能协同PHA促进淋巴细胞增殖,且增殖率最高的是sAMP70,增殖率为6.860%,而未硫酸化多糖AMP40P、AMP70P、AMPtp拮抗PHA对淋巴细胞增殖作用,结果说明,硫酸化能提高白术多糖对淋巴细胞增殖率,其中sAMP70增殖淋巴细胞效果最好。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 多糖的研究进展
• 1.1 多糖的提取方法
• 1.2 多糖的分离纯化
• 1.3 多糖的纯度鉴定
• 1.4 多糖的生物活性
• 2 白术及白术多糖
• 2.1 白术的概况
• 2.2 白术多糖
• 2.3 白术多糖的生物活性
• 3 硫酸化多糖的研究进展
• 3.1 硫酸化多糖的来源
• 3.2 硫酸化多糖的生物活性
• 4 本课题的目的意义
• 参考文献
• 第二章 白术多糖的提取
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 白术多糖的提取
• 1.5 多糖含量的测定
• 1.6 蛋白含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 各白术多糖的提取率、糖含量和蛋白含量
• 3 讨论
• 3.1 白术多糖的提取
• 3.2 多糖含量的测定
• 3.3 蛋白含量的测定
• 参考文献
• 第三章 白术多糖抗病毒活性比较
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖的准备
• 1.2 主要试剂及配制
• 1.3 主要仪器
• 1.4 病毒准备
• 1.5 白术多糖对CEF细胞安全浓度的测定
• 1.6 多糖抗NDV感染细胞能力的测定
• 1.7 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 多糖对CEF生长的影响和最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.4 多糖和病毒感作后加时NDV感染细胞能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖时多糖对NDV感染CEF能力的影响
• 3.2 后加多糖时多糖对NDV感染CEF能力的影响
• 3.3 多糖与病毒感作后加时多糖对NDV感染CEF能力的影响
• 3.4 测定多糖对细胞安全浓度的必要性
• 参考文献
• 第四章 白术多糖增强免疫活性的比较
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 多糖对鸡外周血淋巴细胞的最大安全浓度
• 2.2 多糖单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.3 多糖与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 白术多糖单独作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 白术多糖与PHA共同作用时对淋巴细胞增殖的影响
• 3.3 关于MTT法测定淋巴细胞增殖
• 参考文献
• 第五章 白术多糖硫酸化修饰条件的优选
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 多糖的纯化
• 2.1 去处蛋白
• 2.2 纤维柱DEAE-52层析
• 3 正交试验
• 3.1 因素水平确定
• 3.2 试剂制备
• 3.3 酯化操作
• 3.4 硫酸基取代度测定
• 4 结果
• 4.1 多糖的纯化
• 4.2 正交试验结果
• 5 讨论
• 5.1 多糖的纯化
• 5.2 多糖硫酸化条件的筛选
• 参考文献
• 第六章 硫酸化白术多糖抗病毒活性的比较
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 多糖的准备
• 1.2 病毒的准备
• 1.3 主要试剂及仪器
• 1.4 白术多糖及其硫酸化白术多糖对CEF的生长及安全浓度的测定
• 1.5 多糖抗NDV感染细胞能力的测定
• 1.6 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 白术多糖及其硫酸化白术多糖对CEF的生长及其最大安全浓度
• 2.2 先加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.3 后加多糖时NDV感染CEF能力的变化
• 2.4 多糖和病毒感作后加时NDV感染CEF能力的变化
• 3 讨论
• 3.1 先加多糖时多糖抵抗NDV感染CEF能力的影响
• 3.2 后加多糖时多糖抵抗NDV感染CEF能力的影响
• 3.3 多糖和病毒感作加时多糖抵抗NDV感染CEF能力的影响
• 3.4 sAMP抗病毒活性与取代度的作用关系
• 参考文献
• 第七章 硫酸化白术多糖增强免疫活性比较
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验药物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 试验方法
• 1.5 数据分析
• 2 结果
• 2.1 多糖单独作用时淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 多糖与PHA共同作用时淋巴细胞增殖的变化
• 3 讨论
• 3.1 硫酸化多糖单独作用时对提高多糖淋巴细胞增殖率的影响
• 3.2 硫酸化多糖与PHA共同作用时对提高多糖淋巴细胞增殖率的影响
• 参考文献
• 全文结论
• 论文创新点
• 致谢