GaIE在酿酒酵母表面的固定化表达及NodC在大肠杆菌中的表达及活性测定

论文摘要

UDP-半乳糖4-异构酶（EC 5．1．3．2，Gal E）来自Escherichia coli K-12，催化UDP-半乳糖与UDP-葡萄糖之间的相互转化反应。对本实验室保存的DH5α（pET15b／Gal E）进行培养，提取质粒pET15b／Gal E，用Gal E两端特异性的引物进行PCR扩增，扩增后的片断双酶切，然后与商业化的载体pYD1质粒连接，转化大肠杆菌top10，Ampr筛选阳性克隆并用双酶切和PCR初步鉴定重组质粒pYD1／Gal E，基因测序验证后转化进入酿酒酵母细胞Saccharomyces cerevisiaeEBY100，用YNB-葡萄糖转化培养基筛选。阳性转化子经菌落PCR鉴定，进一步通过免疫荧光试验证明UDP-半乳糖4-异构酶已经成功的锚定在EBY100酵母细胞表面。UDP-半乳糖4-异构酶将通过酵母菌的分泌系统和Aga1-Aga2融合蛋白自动连接到酵母菌细胞壁上，实现UDP-半乳糖4-异构酶的表达—纯化—固定一步化。含2％葡萄糖的YNB-CAA（0.67％YNB；0.5％Casamino acids）培养基培养含有Gal E的重组酵母菌EBY100，当菌体浓度达到OD600=2.0时，转接到含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基中，使OD600=0.5；20℃诱导培养Gal E在酵母菌表面表达。表面表达时，不同蛋白诱导时间不同，本试验中诱导时间过短（如＜24h）细胞的培养液OD600偏小，菌液太稀；时间过长（如＞36h），培养液OD600变化不大，菌液泛黄，所以采用诱导30h。分别用0.6mM UDP-半乳糖、0.6mM UDP-葡萄糖做底物与酵母细胞（干重约10mg）组成5ml体系，24℃反应。反应结束后，煮沸离心，取上清毛细管电泳进行酶活测定。结果显示：表达在酵母表面的Gal E蛋白在催化UDP-半乳糖与UDP-葡萄糖之间的相互转化时具有很高的活性，以UDP-半乳糖作为底物反应速度较快，达到反应平衡仅需要3 min；相比大肠杆菌表达的UDP-半乳糖4-异构酶（达到反应平衡需要15 min）活性高。实验表明：我们已经成功地在酿酒酵母表面锚定了高活性的UDP-半乳糖4-异构酶，这样避免了在大肠杆菌表达时的复杂纯化步骤。通过大量的培养酵母细胞获得比较纯的酶，并且能实现酶的反复利用，大大降低了成本，有利于工业化生产。

论文目录

• 目录
• 第一部分 GalE在酿酒酵母表面的固定化表达
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1 寡糖合成
• 1.1 寡糖合成的意义
• 1.2 寡糖合成的常用方法
• 2 生物表面展示系统
• 2.1 生物表面展示系统的比较
• 2.2 酿酒酵母的表面表达原理
• 2.3 a凝集素目的蛋白表面展示系统研究进展
• 2.4 酵母表面展示系统优点
• 2.5 表面展示系统应用
• 3 异构酶简介
• 3.1 异构酶在生物中的分布
• 3.2 异构酶的结构与催化机理
• 4.本论文的研究目的和意义
• 4.1 实验目的
• 4.2 实验的意义
• 4.3 现状与问题
• 第二章 实验部分
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验所用基因、载体和菌株
• 1.2 培养基
• 1.3 实验所用试剂
• 1.4 主要仪器
• 2.实验方法与技术
• 2.1 目的基因GalE的获得
• 2.2 重组质粒的构建
• 2.3 重组检测及GalE基因的测序
• 3.结果与讨论
• 3.1 原始质粒的提取及GalE基因的PCR扩增
• 3.2 质粒pYD1的提取双酶切及GalE基因PCR扩增产物溶液回收酶切
• 3.3 pYD1质粒的双酶切后大片段的胶回收及GalE基因双酶切后的胶回收
• 3.4.阳性转化子的菌落PCR验证及重组质粒的双酶切验证及基因测序
• 3.5 含有重组质粒阳性酿酒酵母转化子的菌落PCR
• 3.6 GalE蛋白表面表达情况的疫荧光分析
• 3.7 毛细管电泳检测GalE蛋白活性
• 3.8 总结与讨论
• 参考文献
• 第二部分 NodC在大肠杆菌中的表达及活性测定
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.生物固氮
• 1.1 生物固氮的原理
• 1.2 生物固氮的应用及前景
• 2 结瘤因子
• 2.1 根瘤菌的分类
• 2.2 根瘤菌结瘤因子的化学结构与生物合成
• 3.共生固氮各阶段的信息传递和基因表达
• 3.1 根际的殖民化
• 3.2 根毛细胞变形和卷曲
• 3.3 侵染和侵染线的形成
• 3.4 根瘤原基和分生组织的形成
• 3.5 根瘤发育
• 4.NodC的结构与功能
• 5.实验的研究目的和意义
• 第二章 实验部分
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验所用基因载体和菌株
• 1.2 实验试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法与技术
• 2.1 目的基因的PCR克隆
• 2.2 目的基因与pET22b载体构建重组质粒
• 2.3 重组质粒的转化及检测
• 2.4 目的蛋白的表达与制备
• 2.5 蛋白活性的体外测定
• 3.实验结果与讨论
• 3.1 提取原始质粒和用来作为新载体的pET22b质粒
• 3.2 目的基因的PCR
• 3.3 目的基因与载体pET22b酶切及胶回收
• 3.4 重组质粒转化大肠杆菌后菌落PCR检测
• 3.5 从菌落PCR阳性转化子提取重组质粒
• 3.6 重组质粒的双酶切验证
• 3.7 目的基因测序结果
• 3.8 蛋白的镍柱纯化
• 3.9 蛋白质电泳
• 3.10 液相色谱进行蛋白的活性测定
• 3.12 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表