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肝素和白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的作用

2020-12-10阅读(978)

肝素和白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的作用

论文摘要

目的：本实验旨在研究不同浓度的肝素、白血病抑制因子（Leukemia inhibitoryfactor，LIF）对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stemcells，mESCs）的影响，并探索肝素联合LIF培养小鼠胚胎干细胞的最佳浓度。方法：实验以自制无血清代用品为基础培养基、经丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层培养小鼠胚胎干细胞。并观察在此基础培养基中分别添加肝素、LIF及肝素联合LIF对小鼠胚胎干细胞的培养效果。1、观察在基础培养基中加入不同浓度的肝素所培养的细胞的生长情况，初步明确肝素对小鼠胚胎干细胞生长的影响。2、观察在基础培养基中加入不同浓度的LIF所培养的细胞的生长情况，明确LIF在自制无血清代用品中对小鼠胚胎干细胞生长的影响。并用AKP染色法检测小鼠胚胎干细胞的未分化情况，同时应用流式细胞术检测SSEA-1、SSEA-3以及细胞免疫荧光法检测Oct-4的表达情况。3、观察在基础培养基中加入固定浓度的LIF和不同浓度的肝素所培养的细胞的生长情况，明确LIF和肝素在自制无血清代用品中共同对小鼠胚胎干细胞生长的影响，并用AKP染色法检测小鼠胚胎干细胞的未分化情况，同时流式细胞术检测SSEA-1、SSEA-3的表达情况以及细胞免疫荧光法检测Oct-4的表达情况。结果：1、在自制无血清的基础培养基中培养的小鼠胚胎干细胞不能贴壁，随着培养时间延长细胞逐渐死亡或是过度分化。在上述培养基中加入一定量肝素所培养的小鼠胚胎干细胞能够贴壁生长，同时对干细胞有一定的促增殖作用，呈现剂量依赖性，在该部分实验中以100ng/ml这一浓度下的细胞生长状态最佳，最高可传代6代。2、在自制无血清的基础培养基中添加一定量LIF能够明显促进小鼠胚胎干细胞的贴壁生长，并能较好的维持未分化状态生长。10ng/ml这一浓度下培养的细胞生长状态较好，连续传6代未见分化。取培养第3代的小鼠胚胎干细胞进行未分化检测：流式细胞术检测胚胎干细胞表面特异性抗原SSEA-1表达率为64.05%，SSEA-3的表达率为1.0%；AKP染色和细胞免疫荧光检测Oct-4均为阳性结果。3、在自制无血清的基础培养基中添加添加固定浓度的LIF和不同浓度的肝素培养小鼠胚胎干细胞。以10ng/ml的LIF和100ng/ml的肝素共同培养的小鼠胚胎干细胞的生长状态最佳，连续传6代未见分化。取培养第3代的小鼠胚胎干细胞做未分化检测：流式细胞术检测胚胎干细胞表面特异性抗原SSEA-1表达率为82.49%，SSEA-3的表达率为2.15%，AKP染色和细胞免疫荧光检测Oct-4均为强阳性结果。结论：1、自制无血清代用品中添加肝素后有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长，其生长能力与肝素的浓度呈正比关系，但经多次传代后出现易分化倾向。2、自制无血清代用品中添加LIF有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长。当LIF的浓度低于100ng/ml时，小鼠胚胎干细胞的生长能力与LIF的浓度呈正比关系。但当LIF的浓度为100ng/ml时抑制细胞的生长。3、自制无血清代用品中添加10ng/ml的LIF和不同浓度的肝素均有益于小鼠胚胎干细胞贴壁，并维持小鼠胚胎干细胞的生长，其生长能力与肝素的浓度呈正比关系。当肝素的浓度为100ng/ml时，小鼠胚胎干细胞的生长情况最佳，经多次传代细胞未见明显分化。说明在自制无血清代用品中添加LIF与肝素有助于维持小鼠胚胎干细胞增殖而又保持其未分化状态。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 引言
  • 第2章 实验材料和方法
  • 第一部分 肝素对自制无血清代用品培养的小鼠胚胎干细胞影响
  • 1.实验材料
  • 1.1 细胞系
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 1.4 仪器和设备
  • 1.5 主要试剂配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 制备原代 MEF
  • 2.2 MEF 的传代、冻存
  • 2.3 制备 MEF 饲养层
  • 2.4 MEF 复苏
  • 2.5 小鼠 ESC 复苏
  • 2.6 小鼠 ESC 的培养
  • 3 实验分组及实验步骤
  • 3.1 实验分组
  • 3.2 实验步骤
  • 第二部分 白血病抑制因子对自制无血清代用品培养小鼠胚胎干细胞的影响
  • 1 实验材料
  • 1.1 细胞系
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 1.4 仪器和设备
  • 1.5 主要试剂配制
  • 2 实验方法
  • 2.1 经丝裂霉素 C 处理过的 MEF 复苏
  • 2.2 小鼠 ESC 复苏
  • 2.3 mESCs 的培养
  • 2.4 mESCs 的传代、冻存
  • 3 实验分组和实验步骤
  • 3.1 实验分组
  • 3.2 实验步骤
  • 第三部分 肝素和 LIF 协同对自制无血清培养小鼠胚胎干细胞的影响
  • 1. 实验材料
  • 1.1 细胞系
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂、仪器和设备
  • 2. 实验方法
  • 2.1 经丝裂霉素 C 处理过的 MEF 复苏
  • 2.2 小鼠 ESC 复苏
  • 2.3 ESC 的培养
  • 2.4 ESC 的传代、冻存
  • 3. 实验分组及实验步骤
  • 3.1 实验分组
  • 3.2 实验步骤
  • 第3章 实验结果
  • 第4章 讨论
  • 第5章 全文结论与总结
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间的研究成果
  • 综述
  • 参考文献

    • 相关论文文献

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